專利名稱：在癌癥治療中zd6474、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑和放射療法的組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成和/或血管滲透性降低效應(yīng)的方法，尤其是治療癌癥的方法，癌癥尤其包括實(shí)體瘤，該方法包括聯(lián)合給予ZD6474和電離輻射；并涉及ZD6474在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成和/或血管滲透性降低效應(yīng)的藥物中的用途。
正常的血管生成在包括胚胎發(fā)育、傷口愈合和雌性生殖功能的若干成分在內(nèi)的多種進(jìn)程中起重要作用。不合需要的或病態(tài)的血管生成與包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、粥樣斑、卡波西肉瘤和血管瘤在內(nèi)的疾病狀況有關(guān)(Fan等，1995，TrendsPharmacol.Sci.1657-66；Folkman，1995，Nature Medicine 127-31)。血管滲透性的改變被認(rèn)為在正常和病理生理進(jìn)程中起作用(Cullinan-Bove等，1993，Endocrinology 133829-837；Senger等，1993，Cancer and Metastasis Reviews，12303-324)。已經(jīng)鑒別了一些具有體外內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性的多肽，包括酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF & bFGF)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。由于其受體受限制的表達(dá)，VEGF的生長(zhǎng)因子活性與FGFs的相反，對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞是相對(duì)特異性的。最近的證據(jù)表明VEGF是正常和病理血管生成(Jakeman等，1993，Endocrinology，133848-859；Kolch等，1995，Breast Cancer Research and Treatment，36139-155)和血管滲透性(Connolly等，1989，J.Biol.Chem 26420017-20024)的重要刺激物。通過(guò)用抗體隔絕VEGF的VEGF的拮抗會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的抑制(Kim等，1993，Nature 362841-844)。
受體酪氨酸激酶(RTKs)在生物化學(xué)信號(hào)跨細(xì)胞質(zhì)膜的傳遞中是重要的。這些跨膜分子特有地包含通過(guò)質(zhì)膜內(nèi)的區(qū)段與細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域相連的細(xì)胞外配體結(jié)合域。配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致與受體關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶活性的刺激，這導(dǎo)致酪氨酸殘基在受體和其它細(xì)胞內(nèi)分子上的磷酸化。酪氨酸磷酸化中的這些變化啟動(dòng)了導(dǎo)致多種細(xì)胞響應(yīng)的信號(hào)串聯(lián)。迄今為止，已經(jīng)鑒別了由氨基酸序列同源性定義的至少十九種不同的RTK亞科。目前這些亞科中的一種包含fms樣酪氨酸激酶受體-Flt-1、包含激酶插入片段域的受體-KDR(也稱作Flk-1)以及另一種fms樣酪氨酸激酶受體-Flt-4。已經(jīng)顯示這些相關(guān)RTKs中的兩種-Flt-1和KDR結(jié)合VEGF具有高度親和性(De Vries等，1992，Science 255989-991；Terman等，1992，Biochem Biophys.Res.Comm 1992，1871579-1586)。VEFG與在異種細(xì)胞中表達(dá)的這些受體的結(jié)合與細(xì)胞蛋白和鈣通量的酪氨酸磷酸化中的變化有關(guān)。
VEGF是血管發(fā)生和血管生成的關(guān)鍵刺激物。這些細(xì)胞因子通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、蛋白酶表達(dá)和遷移以及繼發(fā)的細(xì)胞的組織來(lái)誘導(dǎo)血管芽殖亞型以形成毛細(xì)管(Keck，P.J.，Hauser，S.D.，Krivi，G.，Sanzo，K.，Warren，T.，F(xiàn)eder，J.，和Connolly，D.T.，Science(Washington DC)，2461309-1312，1989；Lamoreaux，W.J.，F(xiàn)itzgerald，M.E.，Reiner，A.，Hasty，K.A.，和Charles，S.T.，Microvasc.Res.，5529-42，1998；Pepper，M.S.，Montesano，R.，Mandroita，S.J.，Orci，L.和Vassalli，J.D.，Enzyme Protein，49138-162，1996.)。此外，VEGF誘發(fā)顯著的血管滲透性(Dvorak，H.F.，Detmar，M.，Claffey，K.P.，Nagy，J.A.，van de Water，L.，和Senger，D.R.，(Int.Arch.Allergy Immunol.，107233-235，1995；Bates，D.O.，Heald，R.I.，Curry，F(xiàn).E.和Williams，B.J.Physiol.(Lond.)，533263-272，2001)，促進(jìn)高滲透性的、不成熟的血管網(wǎng)絡(luò)形成，這是病理的血管生成的特征。
已有顯示單獨(dú)KDR的激活足以促進(jìn)對(duì)VEGF的所有主表型響應(yīng)，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和存活，以及血管滲透性的誘發(fā)(Meyer，M.，Clauss，M.，Lepple-Wienhues，A.，Waltenberger，J.，Augustin，H.G.，Ziche，M.，Lanz，C.，Biittner，M.，Rziha，H-J.，和Dehio，C.，EMBO J.，18363-374，1999；Zeng，H.，Sanyal，S.和Mukhopadhyay，D.，J.Biol.Chem，27632714-32719，2001；Gille，H.，Kowalski，J.，Li，B.，LeCouter，J.，Moffat，B，Zioncheck，T.F.，Pelletier，N.和Ferrara，N.，J.Biol.Chem.，2763222-3230，2001)。
電離輻射和VEGF抗體在多種小鼠異體移植物模型中的應(yīng)用已有描述(Gorski等，1999，Cancer Res.59，3374-3378和國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 00/61186)。
電離輻射和可溶性VEGF受體(可溶性Flk-1)以及電離輻射和KDR抑制劑-SU5416在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤異體移植物模型中的應(yīng)用已有描述(Geng等，2001，Cancer Res.61，2413-2419)。
在國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO98/13354和WO 01/32651中公開(kāi)了是VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑的喹唑啉衍生物。在WO 98/13354和WO01/32651中，化合物被描述具有抗VEGF受體酪氨酸激酶活性同時(shí)具有某些抗EGF受體酪氨酸激酶活性。本發(fā)明的化合物-ZD6474落入了WO98/13354的廣泛一般的公開(kāi)并且在WO 01/32651中被舉例說(shuō)明。
在WO 01/32651中，它陳述了該發(fā)明的化合物“可以作為單獨(dú)治療劑應(yīng)用，或者除本發(fā)明的化合物外可以包含一種或多種其它的物質(zhì)和/或療法。這些聯(lián)合療法可以通過(guò)同時(shí)、相繼或分隔給藥治療的單獨(dú)成分的途徑來(lái)完成”。
然后WO 01/32651繼續(xù)描述了這種聯(lián)合療法的實(shí)施例，包括手術(shù)、放射療法和各種類型的化學(xué)治療劑。在WO01/32651中沒(méi)有陳述本發(fā)明任何化合物與其它療法的使用將產(chǎn)生令人驚奇的有益效果。
現(xiàn)在我們出乎意料地和令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，特定化合物ZD6474與在WO 01/32651中列出的組合療法的特定選擇—稱作電離輻射的組合使用，產(chǎn)生超過(guò)單獨(dú)使用ZD6474和電離輻射中任一個(gè)的顯著更好的效果。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，ZD6474與電離輻射的組合使用產(chǎn)生超過(guò)單獨(dú)使用ZD6474和電離輻射中任一個(gè)的顯著更好的抗癌效果。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，ZD6474與電離輻射的組合使用產(chǎn)生超過(guò)單獨(dú)使用ZD6474和電離輻射中任一個(gè)的顯著更好的抗實(shí)體瘤效果。
本發(fā)明的治療方法的抗癌效果包括但不限于抗腫瘤效應(yīng)、應(yīng)答率、疾病進(jìn)展的時(shí)間和生存率。本發(fā)明的治療方法的抗腫瘤效果包括但不限于抑制腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)延遲、腫瘤退化、腫瘤收縮、在治療停止基礎(chǔ)上腫瘤再生的時(shí)間延長(zhǎng)、減緩疾病進(jìn)程。據(jù)預(yù)期當(dāng)本發(fā)明的治療方法被施用于患有或未患實(shí)體瘤的需要癌癥治療的溫血?jiǎng)游锢缛藭r(shí)，所述治療方法將產(chǎn)生例如通過(guò)抗腫瘤效應(yīng)范圍、響應(yīng)率、疾病進(jìn)展的時(shí)間和生存率中的一種或多種測(cè)量到的效應(yīng)。
按照本發(fā)明，其提供在溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成和/或血管滲透性降低效應(yīng)的方法，其包括在給予有效量的電離輻射之前、之后或同時(shí)，給予所述動(dòng)物有效量的4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉，也稱作ZD6474 ZD6474或其可藥用鹽。
按照本發(fā)明的另一方面，其提供治療溫血?jiǎng)游锢缛税┌Y的方法，其包括在給予有效量的電離輻射之前、之后或同時(shí)，給予所述動(dòng)物有效量的ZD6474或其可藥用鹽。
按照本發(fā)明的另一方面，其提供治療溫血?jiǎng)游锢缛说陌┌Y包括實(shí)體瘤的方法，其包括在給予有效量的電離輻射之前、之后或同時(shí)，給予所述動(dòng)物有效量的ZD6474或其可藥用鹽。
按照本發(fā)明的另一方面，其提供ZD6474或其可藥用鹽在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成的和/或血管滲透性降低效應(yīng)的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的另一方面，其提供ZD6474或其可藥用鹽在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗癌效應(yīng)的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的另一方面，其提供ZD6474或其可藥用鹽在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的藥物中的用途。
正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥冈诮o予包含ZD6474的藥物之前、之后或同時(shí)用電離輻射治療溫血?jiǎng)游锢缛?。例如所述電離輻射可以在給予包含ZD6474的藥物一星期前至一星期后的時(shí)間段內(nèi)給予所述溫血?jiǎng)游锢缛?。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，ZD6474在動(dòng)物用電離輻射治療完后被給予溫血?jiǎng)游?。溫血?jiǎng)游飼?huì)同時(shí)經(jīng)歷ZD6474和電離輻射每一個(gè)的效應(yīng)。
如上所述，對(duì)如本文定義的本發(fā)明的組合療法感興趣的是它們的抗血管生成和/或血管滲透性作用。本發(fā)明的這種組合療法被預(yù)期用于預(yù)防和治療在其中不適當(dāng)?shù)难苌砂l(fā)生的廣泛的疾病狀況，包括癌癥和卡波西肉瘤。癌癥會(huì)影響任何組織，并包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤。本發(fā)明的這種組合療法尤其被預(yù)期能有利地減緩例如結(jié)腸、乳腺、前列腺、肺和皮膚的原發(fā)的和繼發(fā)的實(shí)體瘤。更具體地，本發(fā)明的組合療法被預(yù)期能有利地減緩肺癌腫瘤的生長(zhǎng)，尤其是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。更特別地，本發(fā)明的這種組合療法被預(yù)期能抑制任何形式的與VEGF相關(guān)的癌癥包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤，并且例如也能抑制那些與VEGF相關(guān)的原發(fā)的和再發(fā)的實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，特別是那些它們的生長(zhǎng)和擴(kuò)散顯著地依賴于VEGF的腫瘤，包括例如某些結(jié)腸、乳腺、前列腺、肺、外陰和皮膚腫瘤，尤其是NSCLC。
在本發(fā)明的另一方面中，ZD6474和電離輻射被預(yù)期能抑制與EGF相關(guān)的那些原發(fā)和再發(fā)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，特別是它們的生長(zhǎng)和擴(kuò)散顯著地依賴于EGF的那些腫瘤。
在本發(fā)明的另一方面中，ZD6474和電離輻射被預(yù)期能抑制與VEGF和EGF相關(guān)的那些原發(fā)和再發(fā)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，特別是它們的生長(zhǎng)和擴(kuò)散顯著地依賴于VEGF和EGF的那些腫瘤。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的治療方法的效應(yīng)被預(yù)期至少等價(jià)于單獨(dú)使用所述治療的每個(gè)成分的效應(yīng)的加和，即單獨(dú)使用ZD6474和電離輻射中每一個(gè)。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的治療方法的效應(yīng)被預(yù)期大于單獨(dú)使用所述治療的每個(gè)成分的效應(yīng)的加和，即單獨(dú)使用ZD6474和電離輻射中每一個(gè)。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明治療方法的效應(yīng)被預(yù)期有協(xié)同效應(yīng)。
也應(yīng)該理解，如果效應(yīng)在治療上優(yōu)于以常規(guī)劑量給藥組合療法中的成分的不管哪一個(gè)獲得的效應(yīng)，則組合療法被定義為提供協(xié)同效應(yīng)，這一點(diǎn)例如通過(guò)響應(yīng)范圍、響應(yīng)率、減少進(jìn)程的時(shí)間或存活期來(lái)測(cè)量。例如，如果效應(yīng)在治療上優(yōu)于單獨(dú)用ZD6474或電離輻射獲得的效應(yīng)，則該組合療法的效應(yīng)是協(xié)同的。此外，如果在一組對(duì)單獨(dú)的ZD6474或電離輻射不響應(yīng)(或響應(yīng)很差)的患者身上獲得了有益效果，則該組合療法的效應(yīng)是協(xié)同的。另外，如果成分中的一種以它的常規(guī)劑量給藥且其它成分以減少的劑量給藥，并且如通過(guò)響應(yīng)范圍、響應(yīng)率、減少進(jìn)程的時(shí)間或存活期測(cè)量的治療效應(yīng)等價(jià)于給藥組合療法中成分的常規(guī)劑量獲得的效應(yīng)，則該組合療法的效應(yīng)被定義為提供協(xié)同效應(yīng)。特別地，與當(dāng)使用每個(gè)成分的常規(guī)劑量發(fā)生的效應(yīng)相比，如果ZD6474或電離輻射的常規(guī)劑量可以降低而沒(méi)有對(duì)響應(yīng)范圍、響應(yīng)率、減少進(jìn)程的時(shí)間或存活期中的一種或多種的危害，尤其是不危害響應(yīng)的持續(xù)，但是有很少和/或不麻煩的副作用，則協(xié)同被認(rèn)為存在。
如本文所定義的本發(fā)明的組合療法可以通過(guò)同時(shí)、相繼或分隔的給予所述療法的單獨(dú)組分的方式完成。如本文所定義的組合療法可以作為單獨(dú)的療法應(yīng)用或者除本發(fā)明的組合療法之外還可以包括手術(shù)。手術(shù)可以包括在給予利用本文描述的利用ZD6474的組合療法之前、之中或之后部分或完全腫瘤切除的步驟。
本文描述的組合物可以是適于口服給藥的形式，例如作為片劑或膠囊，適于鼻內(nèi)給藥或通過(guò)吸入給藥的形式，例如粉劑或溶液劑，適于胃腸外注射的形式(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、血管內(nèi)或輸注)例如作為無(wú)菌溶液、混懸液或乳劑，適于局部給藥的形式，例如軟膏或乳膏，用于直腸給藥的形式，例如栓劑，或可以是通過(guò)直接注射入腫瘤或通過(guò)局域給藥或局部給藥的給藥途徑。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，組合療法的ZD6474可以內(nèi)窺鏡地、氣管內(nèi)地、內(nèi)部損害地、經(jīng)皮地、靜脈內(nèi)地、皮下地、腹膜內(nèi)地或腫瘤內(nèi)地給藥。優(yōu)選地，ZD6474是口服給藥。通常，本文描述的組合物可以利用常規(guī)賦形劑以常規(guī)方式制備。本發(fā)明的組合物有利地以單元?jiǎng)┬痛嬖凇?br> ZD6474一般以每平方米動(dòng)物機(jī)體面積10-500mg范圍內(nèi)的單元?jiǎng)┝拷o予溫血?jiǎng)游?，例如大約0.3-15mg/kg給予人。設(shè)想單元?jiǎng)┝康姆秶缡?.3-15mg/kg，優(yōu)選0.5-5mg/kg，并且這通常是治療有效量。例如片劑或膠囊的單元?jiǎng)┬屯ǔ?5-500mg活性成分。優(yōu)選使用0.5-5mg/kg范圍的日劑量。
特別地，在本發(fā)明具體實(shí)施方案中使用的電離輻射可以是X-輻射、γ-輻射或β-輻射。
電離輻射的劑量將是在臨床放射療法中應(yīng)用已知的那些。使用的輻射療法將包括例如應(yīng)用γ-射線、X-射線、和/或來(lái)自來(lái)自放射性同位素的直接傳遞。DNA損害因子的其它形式也包括在本發(fā)明中例如微波和紫外線照射。最可能的是，所有這些因子在DNA上、在DNA的前體上、在DNA的復(fù)制和修復(fù)上和在染色體的組裝和維持上引起廣泛的損傷。例如X-射線可以以1.8-2.0Gy的日劑量，一周五天給藥5-6星期。通常總分次劑量在45-60Gy范圍。單次較大劑量，例如5-10Gy可以作為放射療法過(guò)程的部分給予。單次劑量可以在手術(shù)中給予。可以采用超分割放射療法，其中經(jīng)一段時(shí)間規(guī)則地給予小劑量的X-射線，例如經(jīng)許多天每小時(shí)0.1Gy。放射療法的劑量范圍變化很廣，并且依賴于同位素的半衰期、發(fā)射的輻射的強(qiáng)度和類型和細(xì)胞的攝取。
如上所述，需要用來(lái)治療性或預(yù)防性治療特定疾病狀況的每一療法的劑量的大小將必須取決于治療的宿主、給藥途徑和被治療的疾病的嚴(yán)重性而變化。因此，可以由治療任何特定患者的醫(yī)生決定最適宜劑量。例如，可能是必須或希望的能減少上述組合療法中成分的劑量以便減少毒性。
本發(fā)明涉及電離輻射與ZD6474或與ZD6474的鹽的組合。
用于藥物組合物的ZD6474的鹽是可藥用鹽，但是其它鹽可以用于生產(chǎn)ZD6474和其可藥用鹽。這種鹽可以用提供可藥用陽(yáng)離子的無(wú)機(jī)或有機(jī)堿形成。這種用無(wú)機(jī)或有機(jī)堿的鹽包括，例如堿金屬鹽例如鈉或鉀鹽，堿土金屬鹽例如鈣或鎂鹽，銨鹽或用甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、嗎啉或三-(2-羥乙基)胺的鹽。
ZD6474例如可以按照由實(shí)施例(a)-(c)舉例說(shuō)明的下述方法中的任何一個(gè)來(lái)制備，除非另外說(shuō)明-(i)通過(guò)在真空中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行蒸發(fā)，并在通過(guò)過(guò)濾除去殘留固體例如干燥劑后逐步進(jìn)行操作；(ii)在環(huán)境溫度即在18-25℃和在惰性氣氛例如氬氣下進(jìn)行操作；(iii)在獲得自E.Merck(Darmstadt，德國(guó))的Merck硅膠二氧化硅(Art.9385)或MerckLichroprep RP-18(Art.9303)反相二氧化硅柱上執(zhí)行柱層析(通過(guò)閃光程序)和中壓液相層析(MPLC)；(iv)給出的產(chǎn)量?jī)H用于說(shuō)明，并不必是最大可獲得的；(v)熔點(diǎn)是未校正的，并且是利用Mettler SP62自動(dòng)熔點(diǎn)儀、油浴裝置或Koffler熱板裝置測(cè)定的。
(vi)通過(guò)核(通常是質(zhì)子)磁共振(NMR)和質(zhì)譜技術(shù)確認(rèn)式I的終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；在δ標(biāo)度上測(cè)量質(zhì)子磁共振化學(xué)位移值且峰多樣性如下表示s，單峰；d，雙峰；t，三峰；m，多重峰；br，寬峰；q，四重峰；在24℃在400MHz機(jī)器上進(jìn)行NMR光譜。
(vii)中間產(chǎn)品通常不是完全特征化的，通過(guò)薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、紅外(IR)或NMR分析來(lái)評(píng)價(jià)純度。
使用下述縮略語(yǔ)-DMF N，N-二甲基酰胺DMSO 二甲基亞砜THF四氫呋喃TFA 三氟醋酸NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮方法(a)將37％的含水甲醛(50μl，0.6毫摩爾)加入4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(139mg，0.3mmol)在THF/甲苯(1.4ml/1.4ml)混合物中的溶液中，然后加入氰基硼氫化鈉(23mg，0.36mmol)。在室溫?cái)嚢?小時(shí)后，加入水，并在真空下除去揮發(fā)物。用水研磨殘留物，過(guò)濾，用水洗滌并真空干燥。通過(guò)在中性氧化鋁上用二氯甲烷洗脫，然后用二氯甲烷/乙酸乙酯(1/1)洗脫，然后用二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(50/45/5)洗脫的色譜法純化該固體。在真空下蒸發(fā)包含預(yù)期產(chǎn)品的餾分。將得到白色固體溶解在二氯甲烷/甲醇(3ml/3ml)中，并加入在醚(0.5ml)中的3N鹽酸。在真空下除去揮發(fā)物。將固體用醚研磨，過(guò)濾，用醚洗滌并在真空下干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉鹽酸鹽(120mg，69％)。MS-ESI475-477[MH]+4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基) 喹唑啉鹽酸鹽質(zhì)子化形式的NMR譜顯示2種形式A和B以A∶B大約9∶1的比率存在。
1H NMR譜(DMSOd6；CF3COOD)1.55-1.7(m，A型2H)；1.85-2.0(m，B型4H)；2.03(d，A型2H)；2.08-2.14(br s，A型1H)；2.31-2.38(br s，B型1H)；2.79(s，A型3H)；2.82(s，B型3H)；3.03(t，A型2H)；3.21(br s，B型2H)；3.30(br s，B型2H)；3.52(d，A型2H)；4.02(s，3H)；4.12(d，A型2H)；4.30(d，B型2H)；7.41(s，1H)；7.5-7.65(m，2H)；7.81(d，1H)；8.20(s，1H)；8.88(s，1H)元素分析 發(fā)現(xiàn) C 46.0 H 5.2 N 9.6C22H24N4O2BrF 0.3H2O 2.65HCl需要 C 45.8 H 4.8 N 9.7％如下制備起始物質(zhì)將7-芐氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉鹽酸鹽(8.35g，27.8毫摩爾)(例如如在WO97/22596實(shí)施例1中的描述制備的)和4-溴-2-氟苯胺(5.65g，29.7毫摩爾)在2-丙醇(200ml)中的溶液加熱回流4小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集得到的沉淀物，用2-丙醇洗滌，然后用醚洗滌，并真空干燥得到7-芐氧基-4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉鹽酸鹽(9.46g，78％)。
1H NMR譜(DMSOd6；CD3COOD)4.0(s，3H)；5.37(s，2H)；7.35-7.5(m，4H)；7.52-7.62(m，4H)；7.8(d，1H)；8.14(9s，1H)；8.79(s，1H)MS-ESI456[MH]+元素分析發(fā)現(xiàn)C54.0H3.7N8.7C22H17N3O2BrF 0.9HCl 需要 C 54.2 H 3.7 N 8.6％將7-芐氧基-4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉鹽酸鹽(9.4g，19.1毫摩爾)在TFA(90ml)中的溶液加熱回流50分鐘。使混合物冷卻并倒入冰中。通過(guò)過(guò)濾收集得到的沉淀物并溶解在甲醇(70ml)中。用濃縮的氨水溶液將溶液調(diào)整到pH9-10。通過(guò)蒸發(fā)將混合物濃縮至原始體積的一半。通過(guò)過(guò)濾收集得到的沉淀物，用水洗滌，然后用醚洗滌，真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-羥基-6-甲氧基喹唑啉(5.66g，82％)。
1H NMR譜(DMSOd6；CD3COOD)3.95(s，3H)；7.09(s，1H)；7.48(s，1H)；7.54(t，1H)；7.64(d，1H)；7.79(s，1H)；8.31(s，1H)MS-ESI366[MH]+元素分析 發(fā)現(xiàn)C 49.5 H 3.1 N 11.3C15H11N3O2BrF 需要C 49.5 H 3.0 N 11.5％當(dāng)維持溫度在0-5℃的同時(shí)，將二-叔丁基碳酸氫鹽(41.7g，0.19摩爾)在乙酸乙酯(75摩爾)中的溶液分次加入在5℃冷卻的4-哌啶羧酸乙酯(30g，0.19摩爾)在乙酸乙酯(150ml)中的溶液。在室溫?cái)嚢?8小時(shí)后，將混合物倒入水(300ml)中。分離有機(jī)層，相繼用水(200ml)、0.1N含水鹽酸(200ml)、飽和的碳酸氫鈉(200ml)和鹽水(200ml)洗滌，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)得到4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶)羧酸乙酯(48g，98％)。
1H NMR譜(CDCl3)1.25(t，3H)；1.45(s，9H)；1.55-1.70(m，2H)；1.8-2.0(d，2H)；2.35-2.5(m，1H)；2.7-2.95(t，2H)；3.9-4.1(br s，2H)；4.15(q，2H)將1M氫化鋁鋰在THF(133ml，0.133摩爾)中的溶液分次加入在0℃冷卻的4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶)羧酸乙酯(48g，0.19摩爾)在無(wú)水THF(180ml)中的溶液中。在0℃攪拌2小時(shí)后，加入水(30ml)然后加入2N氫氧化鈉(10ml)。通過(guò)過(guò)濾濾過(guò)硅藻土除去沉淀物，并用乙酸乙酯洗滌。濾液用水、鹽水洗滌，干燥(Mg2SO4)并蒸發(fā)得到1-(叔丁氧基羰基)-4-羥甲基哌啶(36.3g，89％)。
MS(EI)215[M.]+1H NMR譜(CDCl3)1.05-1.2(m，2H)；1.35-1.55(m，10H)；1.6-1.8(m，2H)；2.6-2.8(t，2H)；3.4-3.6(t，2H)；4.0-4.2(br s，2H)將1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷(42.4g，0.378摩爾)加入1-(叔丁氧基羰基)-4-羥甲基哌啶(52.5g，0.244摩爾)在叔丁基甲基醚(525ml)的溶液中。在環(huán)境溫度攪拌15分鐘后，將混合物冷卻至5℃，并在維持溫度在0℃的同時(shí)經(jīng)2小時(shí)分次加入甲苯磺酰氯化物(62.8g，0.33毫摩爾)在叔丁基甲基醚(525摩爾)中的溶液。在環(huán)境溫度攪拌1小時(shí)后，加入石油醚(11)。通過(guò)過(guò)濾除去沉淀物。蒸發(fā)濾液得到固體。將該固體溶解在醚中，并接連用0.5N含水鹽酸(2×500ml)、水、飽和的碳酸氫鈉和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)得到1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲苯基磺酰氧甲基)哌啶(76.7g，85％)。
MS(ESI)392[MNa]+1H NMR譜(CDCl3)1.0-1.2(m，2H)；1.45(s，9H)；1.65(d，2H)；1.75-1.9(m，2H)；2.45(s，3H)；2.55-2.75(m，2H)；3.85(d，1H)；4.0-4.2(br s，2H)；7.35(d，2H)；7.8(d，2H)將碳酸鉀(414mg，3毫摩爾)加入4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-羥基-6-甲氧基喹唑啉(546mg，1.5毫摩爾)在DMF(5ml)中的混懸液中。在室溫?cái)嚢?0分鐘后，加入1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲苯基磺酰氧甲基)哌啶(636mg，1.72毫摩爾)并將混合物在95℃加熱2小時(shí)。在冷卻后，將混合物倒入冷水(20ml)中。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用水洗滌，并真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基喹唑啉(665mg，79％)。
MS-ESI561-563[MH]+1H NMR譜(DMSOd6)1.15-1.3(m，2H)，1.46(s，9H)，1.8(d，2H)，2.0-2.1(m，1H)，2.65-2.9(m，2H)，3.95(s，3H)，4.02(br s，2H)，4.05(d，2H)，7.2(s，1H)，7.48(d，1H)，7.55(t，1H)，7.65(d，1H)，7.8(s，1H)，8.35(s，1H)，9.55(br s，1H)將TFA(3ml)加入4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基喹唑啉(673mg，1.2毫摩爾)在二氯甲烷(10ml)的混懸液中。在環(huán)境溫度攪拌1小時(shí)后，在真空下除去揮發(fā)物。用水/醚混合物研磨殘留物。分離有機(jī)層。用醚再次洗滌水層。用2N氫氧化鈉將水層調(diào)節(jié)至pH10。用二氯甲烷萃取水層。干燥有機(jī)層(MgSO4)并在真空下除去溶劑。用混合物醚/石油醚(1/1)研磨該固體，過(guò)濾，用醚洗滌，并真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(390mg，70.5％)。
MS-ESI461-463[MH]+1H NMR譜(DMSOd6)1.13-1.3(m，2H)，1.75(d，2H)，1.87-2.0(m，1H)，2.5(d，2H)，3.0(d，2H)，3.96(s，3H)，3.98(d，2H)，7.2(s，1H)，7.5(dd，1H)，7.55(t，1H)，7.68(dd，1H)，7.80(s，1H)，8.36(s，1H)，9.55(br s，1H)
元素分析發(fā)現(xiàn) C 54.5 H 4.9 N 12.1C21H22N4O2BrF 需要 C 54.7 H 4.8 N 12.1％方法(b)將37％含水甲醛(3.5ml，42毫摩爾)加入到4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基喹唑啉(3.49g，6.22毫摩爾)(如在上述方法(a)中對(duì)起始物質(zhì)的描述來(lái)制備)在甲酸(35ml)的溶液中。在95℃加熱4小時(shí)后，在真空下除去揮發(fā)物。將殘留物混懸在水中，并通過(guò)緩慢加入2N氫氧化鈉溶液將混合物調(diào)節(jié)至pH10.5。用以酸乙酯萃取混懸液。用鹽水洗滌有機(jī)層，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(2.61g，88％)。
MS-ESI475-477[MH]+1H NMR譜(DMSOd6)1.3-1.45(m，2H)，1.8(d，2H)，1.7-1.9(m，1H)，1.95(t，2H)，2.2(s，3H)，2.85(d，2H)，3.96(s，3H)，4.05(d，2H)，7.19(s，1H)，7.5(d，1H)，7.55(t，1H)，7.67(d，1H)，7.81(s，1H)，8.37(s，1H)，9.54(s，1H)元素分析 發(fā)現(xiàn) C 55.4 H 5.1 N 11.6C22H24N4O2BrF 需要 C 55.6 H 5.1 N 11.8％方法c)將4-氯-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(200mg，0.62毫摩爾)和4-溴-2-氟苯胺(142mg，0.74毫摩爾)在異丙醇(3ml)中的混懸液加熱回流1.5小時(shí)，其包含在異丙醇中的6N鹽酸(110μl，0.68ml)。在冷卻后通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用異丙醇洗滌，然后用醚洗滌，并真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉鹽酸鹽(304mg，90％)。
元素分析 發(fā)現(xiàn) C 47.9 H 4.9 N 10.0C22H24N4O2BrF 0.5H2O 1.8HCl 需要 C 48.2 H 5.0 N 10.1％0.08異丙醇4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉鹽酸鹽質(zhì)子化形式的NMR譜顯示兩種形式A和B以A∶B大約9∶1的比率存在。
1H NMR譜(DMSOd6)1.6-1.78(m，A型2H)；1.81-1.93(br s，B型4H)；1.94-2.07(d，A型2H)；2.08-2.23(br s，A型1H)；2.29-2.37(br s，B型1H)；2.73(d，A型3H)；2.77(d，B型3H)；2.93-3.10(q，A型2H)；3.21(br s，B型2H)；3.27(br s，B型2H)；3.42-3.48(d，formA 2H)；4.04(s，3H)；4.10(d，A型2H)；4.29(d，B型2H)；7.49(s，1H)；7.53-7.61(m，2H)；7.78(d，1H)；8.47(s，1H)；8.81(s，1H)；10.48(br s，formA 1H)；10.79(br s，B型 1H)；11.90(br s，1H)至于另一NMR讀數(shù)，將一些固態(tài)碳酸鉀加入上述4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉鹽酸鹽中，以便在NMR管中釋放游離堿。然后再次記錄NMR譜，并且僅顯示如下描述的一種形式1H NMR譜(DMSOd6；固態(tài)碳酸鉀)1.3-1.45(m，2H)；1.75(d，2H)；1.7-1.9(m，1H)；1.89(t，2H)；2.18(s，3H)；2.8(d，2H)；3.98(s，3H)；4.0(d，2H)；7.2(s，1H)；7.48(d，1H)；7.55(t，1H)；7.68(d，1H)；7.8(s，1H)；8.35(s，1H)；9.75(s，1H)從4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉鹽酸鹽(如上所述制備的)產(chǎn)生4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(游離堿)的樣本，如下將4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基喹唑啉鹽酸鹽(50mg)混懸在二氯甲烷(2ml)中，并用飽和的碳酸氫鈉洗滌。干燥二氯甲烷溶液，并通過(guò)蒸發(fā)除去揮發(fā)物以得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(游離堿)。如此產(chǎn)生的游離堿的NMR僅顯示如下描述的一種形式1H NMR譜(DMSOd6) 1.3-1.45(m，2H)；1.76(d，2H)；1.7-1.9(m，1H)；1.9(t，2H)；2.19(s，3H)；2.8(d，2H)；3.95(s，3H)；4.02(d，2H)；7.2(s，1H)；7.48(d，1H)；7.55(t，1H)；7.68(dd，1H)；7.8(s，1H)；8.38(s，1H)；9.55(br s，1H)至于另一個(gè)NMR讀數(shù)，將一些CF3COOD加入上述4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(游離堿)的NMR DMSO的溶液中，并再次記錄NMR譜。4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基) 喹唑啉三氟醋酸鹽的質(zhì)子化形式的NMR譜顯示兩種形式A和B以A∶B大約9∶1的比率存在。
1H NMR譜(DMSOd6；CF3COOD)1.5-1.7(m，A型2H)；1.93(br s，B型4H)；2.0-2.1(d，A型2H)；2.17(br s，A型1H)；2.35(brs，B型1H)；2.71(s，A型3H)；2.73(s，B型3H)；2.97-3.09(t，A型2H)；3.23(br s，B型2H)；3.34(br s，B型2H)；3.47-3.57(d，A型2H)；4.02(s，3H)；4.15(d，A型2H)；4.30(d，B型2H)；7.2(s，1H)；7.3-7.5(m，2H)；7.6(d，1H)；7.9(s，1H)；8.7(s，1H)如下制備起始物質(zhì)將1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲基苯基磺酰氧甲基)哌啶(40g，0.11摩爾)(如在上面方法(a)中對(duì)起始物質(zhì)的描述制備的)加入4-羥基-3-甲氧基苯甲酸乙酯(19.6g，0.1摩爾)和碳酸鉀(28g，0.2摩爾)在無(wú)水DMF(200摩爾)中的混懸液中。在95℃攪拌2.5小時(shí)后，將混合物冷卻至環(huán)境溫度，并在水和乙酸乙酯/醚之間分配。用水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)。從石油醚結(jié)晶得到的油并將混懸液在5℃貯存過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用石油醚洗滌并真空干燥得到4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(35g，89％)。
m.p.81-83℃MS(ESI)416[MNa]+1H NMR譜(CDCl3)1.2-1.35(m，2H)；1.4(t，3H)；1.48(s，9H)；1.8-1.9(d，2H)；2.0-2.15(m，2H)；2.75(t，2H)；3.9(d，2H)；3.95(s，3H)；4.05-4.25(br s，2H)；4.35(q，2H)；6.85(d，1H)；7.55(s，1H)；7.65(d，1H)元素分析 發(fā)現(xiàn)C63.4H8.0N3.5C21H31NO60.3H2O需要 C 63.2 H 8.0 N 3.5％將甲醛(12M，37％在水中，35ml，420毫摩爾)加入4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(35g，89毫摩爾)在甲酸(35ml)中的溶液中。在95℃攪拌3小時(shí)后，通過(guò)蒸發(fā)除去揮發(fā)物。將殘留物溶解在二氯甲烷中，并加入在醚(40ml，120毫摩爾)中的3M鹽酸。在用醚稀釋后，研磨混合物直到形成固體。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用醚洗滌并在真空下在50℃干燥過(guò)夜，以得到3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(30.6g，定量)。
MS(ESI)308[MH]+1H NMR譜(DMSOd6) 1.29(t，3H)；1.5-1.7(m，2H)；1.95(d，2H)；2.0-2.15(br s，1H)；2.72(s，3H)；2.9-3.1(m，2H)；3.35-3.5(br s，2H)；3.85(s，3H)；3.9-4.05(br s，2H)；4.3(q，2H)；7.1(d，1H)；7.48(s，1H)；7.6(d，1H)將3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(30.6g，89毫摩爾)在二氯甲烷(75ml)中的溶液冷卻至0-5℃。加入TFA(37.5ml)后，經(jīng)15分鐘滴加發(fā)煙的24N硝酸(7.42ml，178毫摩爾)在二氯甲烷(15ml)中的溶液。在添加完成后，加溫溶液并在環(huán)境溫度攪拌2小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物，并將殘留物溶解在二氯甲烷(50ml)中。將該溶液冷卻至0-5℃并加入醚。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，在50℃真空干燥。將該固體溶解在二氯甲烷(500ml)中并加入在醚(30ml)中的3M鹽酸，隨后加入醚(500ml)。通過(guò)過(guò)濾收集固體，在50℃真空干燥得到3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-6-硝基苯甲酸乙酯(28.4g，82％)。
MS(ESI)353[MH]+1H NMR譜(DMSOd6) 1.3(t，3H)；1.45-1.65(m，2H)；1.75-2.1(m，3H)；2.75(s，3H)；2.9-3.05(m，2H)；3.4-3.5(d，2H)；3.95(s，3H)；4.05(d，2H)；4.3(q，2H)；7.32(s，1H)；7.66(s，1H)在1.8大氣壓，將包含10％鉑的3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-6-硝基苯甲酸乙酯(3.89g，10毫摩爾)在甲醇(80摩爾)中的混懸液在活性炭(50％濕)(389mg)上氫化，直到氫的攝取停止。過(guò)濾混合物并蒸發(fā)濾液。將殘留物溶解在水(30ml)中，并用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)至pH10。用乙酸乙酯/醚(1/1)稀釋該混合物并分離有機(jī)層。進(jìn)一步用乙酸乙酯/醚萃取水層并合并有機(jī)層。用水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)。在醚/石油醚中研磨得到的固體，過(guò)濾，用石油醚洗滌，在60℃真空干燥得到乙基-6-氨基-3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(2.58g，80％)。
m.p.111-112℃
MS(ESI)323[MH]+1H NMR譜(CDCl3)1.35(t，3H)；1.4-1.5(m，2H)；1.85(m，3H)；1.95(t，2H)；2.29(s，3H)；2.9(d，2H)；3.8(s，3H)；3.85(d，2H)；4.3(q，2H)；5.55(br s，2H)；6.13(s，1H)；7.33(s，1H)元素分析 發(fā)現(xiàn) C 62.8 H 8.5 N 8.3C17H26N2O40.2H2O 需要 C 62.6 H 8.2 N 8.6％將包含甲脒醋酸鹽(5.2g，50毫摩爾)的氨基-3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(16.1g，50毫摩爾)在2-甲氧基乙醇(160ml)中的溶液在115℃加熱2小時(shí)。經(jīng)4小時(shí)，每30分鐘分次加入甲脒醋酸鹽(10.4g，100毫摩爾)。在最后一次加入后，將加熱延長(zhǎng)30分鐘。在冷卻后，在真空下除去揮發(fā)物。將該固體溶解在乙醇(100ml)和二氯甲烷(50ml)中。通過(guò)過(guò)濾除去沉淀物并將濾液濃縮至最終體積為100ml。將混懸液冷卻至5℃并通過(guò)過(guò)濾收集固體，用冷乙醇洗滌，然后用醚洗滌，并在60℃真空干燥過(guò)夜，得到6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(12.7g，70％)。
MS(ESI)304[MH]+1H NMR譜(DMSOd6)1.25-1.4(m，2H)；1.75(d，2H)；1.9(t，1H)；1.9(s，3H)；2.16(s，2H)；2.8(d，2H)；3.9(s，3H)；4.0(d，2H)；7.11(s，1H)；7.44(s，1H)；7.97(s，1H)將包含DMF(280μl)的6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(2.8g，9.24毫摩爾)在亞硫酰氯(28ml)中的溶液在85℃加熱回流1小時(shí)。冷卻后，通過(guò)過(guò)濾除去揮發(fā)物。用醚研磨沉淀物，過(guò)濾，用醚洗滌并真空干燥。將固體溶解在二氯甲烷中并加入飽和的含水碳酸氫鈉。分離有機(jī)層，用水、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)得到4-氯-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(2.9g，98％)。
MS(ESI)322[MH]+1H NMR譜(DMSOd6)1.3-1.5(m，2H)；1.75-1.9(m，3H)；2.0(t，1H)；2.25(s，3H)；2.85(d，2H)；4.02(s，3H)；4.12(d，2H)；7.41(s，1H)；7.46(s，1H)；8.9(s，1H)
或者，可以如下制備6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮經(jīng)20分鐘將氫化鈉(1.44g在礦物油中的60％混懸液，36毫摩爾)分次加入7-芐氧基-6-甲氧基-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(8.46g，30毫摩爾)(例如如在WO 97/22596實(shí)施例1中的描述制備的)在DMF(70ml)中的溶液，并將此混合物攪拌1.5小時(shí)。分次加入氯甲基特戊酸酯(5.65g，37.5毫摩爾)，并在環(huán)境溫度攪拌該混合物2小時(shí)。將此混合物用乙酸乙酯(100ml)稀釋，并倒入冰/水(400ml)和2N鹽酸(4ml)。分離有機(jī)層并用乙酸乙酯萃取水層，用鹽水洗滌合并的提取物，干燥(MgSO4)并通過(guò)蒸發(fā)除去溶劑。用醚和石油醚的混合物研磨殘留物，通過(guò)過(guò)濾收集固體，并真空干燥得到7-芐氧基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(10g，84％)。
1H NMR譜(DMSOd6)1.11(s，9H)；3.89(s，3H)；5.3(s，2H)；5.9(s，2H)；7.27(s，1H)；7.35(m，1H)；7.47(t，2H)；7.49(d，2H)；7.51(s，1H)；8.34(s，1H)將7-芐氧基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(7g，17.7毫摩爾)和10％在碳上鈀催化劑(700mg)在乙酸乙酯(250ml)、DMF(50ml)、甲醇(50ml)和醋酸(0.7ml)中的混合物在氫下在大氣壓下攪拌40分鐘。通過(guò)過(guò)濾除去催化劑并通過(guò)蒸發(fā)從濾液中除去溶劑。用醚研磨殘留物，通過(guò)過(guò)濾收集，真空干燥得到7-羥基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(4.36g，80％)。
1H NMR譜(DMSOd6)1.1(s，9H)；3.89(s，3H)；5.89(s，2H)；7.0(s，1H)；7.48(s，1H)；8.5(s，1H)在氮下將三苯膦(1.7g，6.5毫摩爾)加入7-羥基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(1.53g，5毫摩爾)在二氯甲烷(20ml)中的混懸液，然后加入1-(叔丁氧基羰基)-4-(羥基甲基)哌啶(1.29g，6毫摩爾)(如在上述方法(a)中對(duì)起始物質(zhì)的描述制備的)，并加入偶氮二羧酸二乙酯(1.13g，6.5毫摩爾)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。在環(huán)境溫度攪拌30分鐘后，將反應(yīng)混合物倒入二氧化硅柱并用乙酸乙酯/石油醚(1/1，然后6/5、6/4和7/3)洗脫。蒸發(fā)包含預(yù)期產(chǎn)品的餾分，得到油，它是用戊烷研磨結(jié)晶的。通過(guò)過(guò)濾收集固體，真空干燥得到7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(232g，92％)。
MS-ESI526[MNa]+1H NMR譜(CDCl3)1.20(s，9H)，1.2-1.35(m，2H)，1.43(s，9H)，1.87(d，2H)，2.05-2.2(m，1H)，2.75(t，2H)，3.96(d，2H)，3.97(s，3H)，4.1-4.25(br s，2H)，5.95(s，2H)，7.07(s，1H)，7.63(s，1H)，8.17(s，1H)元素分析發(fā)現(xiàn)C61.8H7.5N8.3C26H37N3O7需要 C 62.0 H 7.4 N 8.3％將7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(2.32g，4.6毫摩爾)在包含TFA(5ml)的二氯甲烷(23ml)中的溶液在環(huán)境溫度攪拌1小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物。在乙酸乙酯和碳酸氫鈉之間分配殘留物。在真空中除去有機(jī)溶劑并過(guò)濾殘留物。將該固體與甲苯共沸混合，并在真空下干燥得到6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(1.7g，92％)。
MS-ESI404[MH]+1H NMR譜(DMSOd6，CF3COOD)1.15(s，9H)，1.45-1.6(m，2H)，1.95(d，2H)，2.1-2.25(m，1H)，2.95(t，2H)，3.35(d，2H)，3.95(s，3H)，4.1(d，2H)，5.95(s，2H)，7.23(s，1H)，7.54(s，1H)，8.45(s，1H)分次向6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基) -3，4-二氫喹唑啉-4-酮(1.21g，3毫摩爾)在THF/甲醇(10ml/10ml)的混合物的溶液中加入37％的甲醛水溶液(501μl，6毫摩爾)，然后加入氰基硼氫化鈉(228mg，3.6毫摩爾)。在環(huán)境溫度攪拌30分鐘后，在真空下除去有機(jī)溶劑并在二氯甲烷和水之間分配殘留物。分離有機(jī)層，用水和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并通過(guò)蒸發(fā)除去揮發(fā)物。用醚研磨殘留物，并通過(guò)過(guò)濾收集得到的固體，用醚洗滌并真空干燥得到6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(1.02g，82％)。
MS-ESI418[MH]+1H NMR譜(CDCl3)1.19(s，9H)，1.4-1.55(m，2H)，1.9(d，2H)，2.0(t，2H)，1.85-2.1(m，1H)，2.3(s，3H)，2.92(d，2H)，3.96(s，3H)，3.99(d，2H)，5.94(s，2H)，7.08(s，1H)，7.63(s，1H)，8.17(s，1H)將氨水在甲醇(14ml)中的飽和溶液加入6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(1.38g，3.3毫摩爾)在甲醇(5ml)中的溶液。在環(huán)境溫度攪拌20小時(shí)后，用二氯甲烷(10ml)稀釋混懸液。過(guò)濾溶液。在真空下蒸發(fā)濾液，并用醚研磨殘留物，通過(guò)過(guò)濾收集，用醚洗滌并在真空下干燥得到6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氫喹唑啉-4-酮(910mg，83％)。
MS-ESI304[MH]+1H NMR譜(DMSOd6) 1.3-1.45(m，2H)，1.75(d，2H)，1.7-1.85(m，1H)，1.9(t，2H)，2.2(s，3H)，2.8(d，2H)，3.9(s，3H)，4.0(d，2H)，7.13(s，1H)，7.45(s，1H)，7.99(s，1H)采用下述試驗(yàn)來(lái)證明ZD6474與電離輻射組合的活性。
Calu-6異體移植物模型Calu-6(肺癌)細(xì)胞獲得自美國(guó)典型菌種收藏所(American TypeCulture Collection)(Manassas，VA)。所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑，如沒(méi)有指定，都獲得自Life Technologies，Paisley，UK。細(xì)胞被維持為在伊格爾最低必需培養(yǎng)基(EMEM)中指數(shù)生長(zhǎng)單層，該培養(yǎng)基包含10％FCS(Labtech International，Ringmer，UK)、2mM L-谷氨酰胺(SigmaChemical Co.，Poole，UK)、1％丙酮酸鈉(100mM)和1％非必需氨基酸。由于微等離子體在培養(yǎng)物中的存在定時(shí)地篩選細(xì)胞，并且在體內(nèi)常規(guī)應(yīng)用前在小鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)中分析15種病毒(AstraZenecaCentral Toxicology Laboratories，Alderley Park，UK)。
在50％(v/v)基質(zhì)膠(Fred Baker，Liverpool，UK)在無(wú)血清Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基中的混合物中制備用于植入的Calu-6細(xì)胞(2×107細(xì)胞/毫升)。通過(guò)將0.1ml細(xì)胞混懸液(即2×106細(xì)胞/小鼠)皮下注射入雌性Alderley Park裸鼠(nu/nu基因型；年齡為8-10星期)來(lái)建立腫瘤異體移植物。一旦可觸及的腫瘤是明顯的，就用測(cè)徑器測(cè)量和利用公式長(zhǎng)度×寬度×高度來(lái)每天評(píng)價(jià)腫瘤體積。
在治療前，當(dāng)腫瘤測(cè)量值為225-315mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成八組。以每分鐘2Gy的給藥頻率給予受限制于聚乙烯夾具的未麻醉的小鼠電離輻射，該夾具有鉛遮板和切掉的區(qū)域以允許通過(guò)單側(cè)光的腫瘤的局部輻射(PantacX射線機(jī))。在射線照射期間通過(guò)180℃半途旋轉(zhuǎn)夾具以提供均勻的劑量。輻射是單次給予(在第1天5Gy)或通過(guò)多次每日給予(在第1-3天2Gy/天)來(lái)給予。在輻射最后給予后30分鐘，通過(guò)口服管飼法給藥ZD6474(25mg/kg)或介質(zhì)(0.1ml/10g體重)，并且此后每天一次再給13天(即總共口服治療14天)。ZD6474被制備為在1％聚山梨酯80(即聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯在去離子水中的1％(v/v)溶液)中的混懸液。當(dāng)小鼠腫瘤的相對(duì)體積達(dá)到治療起始的四倍(RTV4)時(shí)，人工處死小鼠。采用雙尾雙樣本t-檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)獲得的結(jié)果的顯著性。
表1-RTV4天數(shù)
數(shù)據(jù)用圖顯示在

圖1和圖2中。
數(shù)據(jù)表明在各情況下(5Gy或3×2Gy試驗(yàn))，輻射加上ZD6474的組合都比每一單獨(dú)療法提供更好的療效。
雙樣本t-檢驗(yàn)的P值(假定有不對(duì)稱的方差)在上文描述的應(yīng)用Calu-6異體移植物模型的模擬試驗(yàn)中觀察了不同的方案。
將患有Calu-6腫瘤(220-300mm3)小鼠隨機(jī)分成八組，在試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間中僅接受ZD6474(每天口服50mg/kg)或介質(zhì)(在去離子水中的1％的聚山梨酯)。ZD6474或介質(zhì)也與或不與放射療法(在治療的最初3天以24小時(shí)間隔3×2Gy)一同給予。對(duì)于接受50mg/kgZD6474加輻射療法的小鼠，檢測(cè)兩種治療方案a)同時(shí)組合治療在第一次給予輻射2小時(shí)之前給予ZD6474；和b)相繼組合治療在最后一次給予放射療法之后30分鐘給予ZD6474。
用介質(zhì)和5×2Gy放射療法以24小時(shí)間隔治療另一組有Calu-6異體移植物的小鼠。
通過(guò)測(cè)量腫瘤從它們的治療前的大小達(dá)到四倍體積(RTV4)的時(shí)間和計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)延遲(與對(duì)照組比較單獨(dú)治療組的RTV4值)來(lái)評(píng)價(jià)治療有效性。
表2-RTV4和腫瘤生長(zhǎng)延遲天數(shù)
*基于n＝7；一個(gè)腫瘤/組在治療后100天內(nèi)沒(méi)有達(dá)到RTV4數(shù)據(jù)用圖顯示在圖3中。
數(shù)據(jù)顯示50mg/kg劑量的ZD6474與3×2Gy輻射療法組合得到的生長(zhǎng)延遲顯著大于單獨(dú)用單一療法得到的生長(zhǎng)延遲。輻射和50mg/kgZD6474的相繼結(jié)合療法抑制的腫瘤生長(zhǎng)顯著多于相同藥劑同時(shí)組合(生長(zhǎng)延遲分別為36±1.0天和22±1.1天)。
通過(guò)用3×2Gy輻射和50mg/kg ZD6474相繼組合治療產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)大于通過(guò)單獨(dú)療法誘發(fā)的生長(zhǎng)延遲的總和，并且也比得上單獨(dú)用5×2Gy輻射治療。
權(quán)利要求
1.在溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成和/或血管滲透性降低效應(yīng)的方法，其包括在給予有效量的電離輻射之前、之后或同時(shí)，給予所述動(dòng)物有效量的4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉，也稱作ZD6474 ZD6474或其可藥用鹽。
2.治療溫血?jiǎng)游锢缛税┌Y的方法，其包括在給予有效量的電離輻射之前、之后或同時(shí)，給予所述動(dòng)物有效量的ZD6474或其可藥用鹽。
3.治療溫血?jiǎng)游锢缛说陌┌Y包括實(shí)體瘤的方法，其包括在給予有效量的電離輻射之前、之后或同時(shí)，給予所述動(dòng)物有效量的ZD6474或其可藥用鹽。
4.ZD6474或其可藥用鹽在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成的和/或血管滲透性降低效應(yīng)的藥物中的用途。
5.ZD6474或其可藥用鹽在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗癌效應(yīng)的藥物中的用途。
6.ZD6474或其可藥用鹽在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及在溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成和/或血管滲透性降低效應(yīng)的方法，尤其是治療癌癥的方法，癌癥尤其包括實(shí)體瘤，該方法包括聯(lián)合給予ZD6474和電離輻射；并涉及ZD6474在制備用于正在用電離輻射治療的溫血?jiǎng)游锢缛酥挟a(chǎn)生抗血管生成和/或血管滲透性降低效應(yīng)的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1674905SQ03819101
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者S·R·韋奇 申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司