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      具有抗炎活性的乳桿菌分離株及其用途的制作方法

      文檔序號:1227741閱讀:324來源:國知局

      專利名稱::具有抗炎活性的乳桿菌分離株及其用途的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明是有關(guān)于兩株具有抗炎活性以及有益的益生性質(zhì)(beneficialprobioticproperties)的乳桿菌分離株,也就是沙克乳桿菌(1fl"o6acz7/wsat")GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌(丄""o6flc/〃wrew&〃')GMNL-89,它們分別以保藏編號BCRC910355與BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC),以及以保藏編號CCTCCM207153與CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。這兩株乳桿菌分離株及其繼代培養(yǎng)后代可被用于制備各式的食品產(chǎn)品,以及用于制備用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的藥物組合物。
      背景技術(shù)
      :類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種慢性自身免疫疾病,它會造成關(guān)節(jié)(例如手、足、腕、肘、膝以及踝關(guān)節(jié))的腫脹、變形、疼痛、萎縮以及僵硬。長期的慢性關(guān)節(jié)炎會逐漸侵蝕掉正常的關(guān)節(jié)骨細(xì)胞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形以致最后喪失功能。此外,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也會侵犯關(guān)節(jié)以外的部位,例如腺體(諸如唾液腺、淚腺以及淋巴腺等)、器官(諸如肝臟、脾臟、心臟以及肺臟等)或系統(tǒng)(諸如循環(huán)系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)),進(jìn)而造成類風(fēng)濕性血管炎、胸膜肺征候(pleuropulmonarymanifestations)(包括間質(zhì)纖維化、胸膜肺結(jié)節(jié)、肺炎與動脈炎)以及費(fèi)耳提氏綜合征等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病年齡主要是落在40至50歲之間,而女性的發(fā)病率是男性的2至4倍。至今,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的確切致病原因仍是未知,但是,先前的研究顯示遺傳傾向、環(huán)境誘發(fā)、自身免疫現(xiàn)象、慢性炎癥、細(xì)胞運(yùn)輸以及治療等都可能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要病灶是滑膜組織。正常關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜細(xì)胞不會超過3層,但在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)內(nèi)則會出現(xiàn)明顯的增生。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有可能是肇因于患者的免疫細(xì)胞不正常地攻擊自身的關(guān)節(jié)軟骨與滑膜組織的II型膠原(collagentypeII,CII)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者可被檢測出具有對n型膠原具特異性的自身抗體和/或類風(fēng)濕因子。類風(fēng)濕因子是由IgG的Fc區(qū)域的糖基化缺陷而引發(fā)的自身抗體,其中以IgM最多見,而IgG、IgA也有發(fā)現(xiàn)。類風(fēng)濕因子在大約80%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中可檢測到,它與原始抗原結(jié)合之后所形成的免疫復(fù)合物會沉積于滑膜、軟骨或血管中而造成病變。已知細(xì)胞因子涉及到許多重要的生物學(xué)過程,包括炎癥、組織修復(fù)、細(xì)胞生長、纖維化、血管發(fā)生,以及免疫應(yīng)答。因此,細(xì)胞因子在自身免疫疾病中扮演一個重要的角色。在M.Feldmannefa/.(1996),力w"w.Aev./www"o/.,14:397-440此篇回顧性論文中,M.Feldmann等人借由分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織中細(xì)胞因子的表達(dá)與調(diào)控來探討RA的發(fā)病機(jī)制,其中細(xì)胞因子被區(qū)分為下面四大類別(1)促炎細(xì)胞因子;(2)免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子;(3)趨化性細(xì)胞因子;以及(4)促有絲分裂細(xì)胞因子等。促炎細(xì)胞因子是一群由l型T輔助細(xì)胞(簡稱Thl細(xì)胞)所產(chǎn)生的能夠調(diào)節(jié)延遲型過敏反應(yīng)的分子,包括白細(xì)胞介素-1(IL-1)、干擾素-Y(IFN-力、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等。在風(fēng)濕性疾病中所觀察到的軟骨破壞己被普遍地認(rèn)為是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性所造成,該基質(zhì)金屬蛋白酶是由對促炎細(xì)胞因子(諸如IL-l或TNF-a)有反應(yīng)并被活化的巨噬細(xì)胞與成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生。M.Feldmann等人進(jìn)一步提到將IL-l或TNF-a注射至經(jīng)膠原免疫的小鼠或大鼠體內(nèi),或?qū)FN-Y局部注射到經(jīng)II型膠原免疫的小鼠的腳掌中,皆會加速關(guān)節(jié)炎的發(fā)生并增高疾病的嚴(yán)重性(M.FeldmannW(1996),同上述)。免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(也被稱為抗炎細(xì)胞因子)是一群由2型T輔助細(xì)胞(簡稱Th2細(xì)胞)所產(chǎn)生的能夠抑制炎癥反應(yīng)的分子,包括IL-4、IL-IO、IL-13以及轉(zhuǎn)化生長因子-(3(TGF-P)等。在G.Garciaefa/.(1999),/owrwo/o/y4wWwww"/j,13:315-324中,G.Garcia等人提到TGF-P與IL-10這兩種免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子不僅會抑制誘發(fā)MMP的促炎細(xì)胞因子的生成,也會誘發(fā)MMP的天然抑制劑(也就是基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑TIMP)的生成。G.Garcia等人進(jìn)一步提到IL-10被廣為知曉除了會抑制從Thl細(xì)胞生成IFN-y之外,還會抑制從其它的白細(xì)胞群生成各種不同的細(xì)胞因子。IL-10會抑制從巨噬細(xì)胞生成IL-1、IL-6、TNF-a、IL-8以及G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子),并且會抑制從多形核細(xì)胞生成IL-l、TNF、IL-8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)la(MIPla)以及巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)1P(MIPip),而這些細(xì)胞因子與趨化因子之中的大多數(shù)涉及到關(guān)節(jié)炎的病理過程(G.Garciaefa/.(1999),同上述)。這些研究結(jié)果顯示與Thl細(xì)胞有關(guān)的促炎細(xì)胞因子(諸如TNF-a與IFN-Y)會促進(jìn)炎癥而使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病況更為惡化,而與Th2細(xì)胞有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(諸如IL-10與IL-4)除了可以抑制促炎細(xì)胞因子的生成之外,也可通過誘導(dǎo)TIMP的生成來減少軟骨破壞。目前尚無藥物可有效地治愈類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,因此臨床上所使用的藥物僅能著重于防止關(guān)節(jié)與其它組織或器官的炎癥與破壞、修復(fù)受損關(guān)節(jié)以減輕疼痛、以及維持關(guān)節(jié)的功能并防止變形等。治療的模式可區(qū)分為藥物治療、手術(shù)治療、康復(fù)治療、運(yùn)動治療以及飲食控制等。藥物治療主要是針對炎癥的癥狀進(jìn)行治療,而現(xiàn)今常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物可被歸納為下面五大類(謝調(diào)揚(yáng)與陳培瑛(2001),"類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療",藥學(xué)雜志,17(4):109-116):1.生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM):例如依那西普(商品名稱為Enbrel⑧)與英利西單抗(商品名稱為Remicade),它們是抗-TNF藥劑,可借由特異性地結(jié)合至TNF-a來抑制TNF-a的生物活性,進(jìn)而減輕TNF-(X所造成的炎癥現(xiàn)象;2.非甾體抗炎藥(NSAID):例如阿司匹林與布洛芬,此類藥物具有消炎與止痛的功效,因此可供用于緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者長期或短期的疼痛與炎癥;3.疾病改善型抗風(fēng)濕藥(DMARD):例如來氟米特(商品名稱為八^^@)、氨甲碟呤、青霉胺、羥氯喹以及金化合物等,它們適用于對NSAID沒有反應(yīng)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。DMARD借由調(diào)節(jié)會引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的異常免疫反應(yīng)來延緩疾病過程,而使用此類藥物來進(jìn)行治療時必須有醫(yī)師的監(jiān)督以避免副作用的發(fā)生;4.皮質(zhì)類固醇此類藥物對于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎十分有效,但是會產(chǎn)生許多副作用。皮質(zhì)類固醇通常是以口服或注射的劑型進(jìn)行施用,但是經(jīng)常注射皮質(zhì)類固醇會傷害軟骨,因此注射次數(shù)以每年1至2次為限。目前,口服潑尼松是醫(yī)師最常開立的處方箋;以及5.其它例如透明質(zhì)酸(諸如透明質(zhì)酸鈉(商品名稱為Hyalgan))及其衍生物(諸如HylanG-F20(商品名稱為SynViSC))。透明質(zhì)酸是關(guān)節(jié)軟骨與滑液的主要成份,因此借由透明質(zhì)酸的關(guān)節(jié)內(nèi)注射可以達(dá)到刺激軟骨細(xì)胞增生、保護(hù)與潤滑關(guān)節(jié),以及減輕炎癥的效用。有關(guān)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的選用,一般初期會以效力較弱、安全性較高的NSAID作為第一線用藥,若治療效果不顯著,再以效力較強(qiáng)的DMARD作為第二線用藥。當(dāng)這兩類藥物均無法達(dá)到所期望的療效時,則會考慮使用皮質(zhì)類固醇或施行手術(shù)。雖然藥物具有減輕疼痛、僵硬感及炎癥的功效,但長期服用可能會產(chǎn)生失眠、耳鳴、水腫、胃潰瘍、胃出血、胃穿孔(gastrobrosia)、皮膚敏感性、蛋白尿、糖尿病、高血壓、骨質(zhì)疏松癥、白內(nèi)障、抵抗感染能力降低等副作用,同時在治療的過程中需要定期地作血液生化、血清檢查,以確保治療成效以及避免上述副作用的發(fā)生。迄今,尚未有一種可以有效地治療或緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并且不會產(chǎn)生非所需的副作用的藥物。聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織(FAO)以及世界衛(wèi)生組織(WHO)將益生菌定義為活的微生物,當(dāng)它呈適當(dāng)數(shù)量進(jìn)行施用時,可賦予宿主一健康益處(GuidelinesfortheEvaluationofProbioticsinFood,JointFAO/WHOWorkingGroupReportonDraftingGuidelinesfortheEvaluationofProbioticsinFood,April30andMay1,2002)。目前可作為益生菌使用的微生物有許多種類,例如孚L桿菌屬(Z^"o6ac〃/w)、雙歧木干菌屬(S(/Vco6fl""/w附)、乳球菌屬(丄(3"ococcw"、腸球菌屬(£"ferococc—、酵母、鏈球菌屬(W/^^oco"""等等,特別是前兩個菌屬的菌種。EliMetchnikoff在1908年提出存在于胃腸道(GItract)內(nèi)的有害腐敗菌會被產(chǎn)酸的乳桿菌所抑制或拮抗Me化/zmiq//,/夕0S,rAePro/owga〃ow(9/丄z/e,尸.C/2a/wersMWc/7e〃'G.尸.尸Wwa州Sows,TTieA"m'cA:er6ocA:er/Vew,7Vewc&Zo"dow)。之后,有許多的研究以及臨床試驗(yàn)也陸續(xù)證實(shí)乳桿菌與健康之間存在有重要的相關(guān)性。乳桿菌是一群革蘭氏陽性的兼性厭氧菌,它們普遍存在于人類的胃腸道與陰道內(nèi),它們能夠發(fā)酵糖類并以乳酸為主要代謝產(chǎn)物。乳桿菌已被發(fā)現(xiàn)的功效包括(l)增進(jìn)腸道菌群的菌相平衡;(2)預(yù)防腹瀉;(3)降低結(jié)腸癌的危險(xiǎn)性;(4)剌激胃腸上皮粘膜系統(tǒng)的正常發(fā)育與功能;(5)產(chǎn)生各種維生素與營養(yǎng)素;以及(6)預(yù)防與治療陰道病。基于乳桿菌的有益益生性質(zhì),本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)具有所期望的生物活性的乳桿菌分離株。在此方面,可以參見,侈ij如TW588109揭示鼠李糖孚L桿菌(丄a"o6a"'〃wWaw"osw"Tcell-l及其用途。TW1241912揭示6株具有降低與同化膽固醇能力的新的耐酸與耐膽鹽乳桿菌分離株,它們是加氏乳桿菌(Z^"o6編7/wsB21T1、B21T6、C21T1、X21B7與B38T38以及嗜酸乳桿菌(丄.a"Wo;/n7^)B6T7。TW1283268公開了鼠李糖乳桿菌GM-020及其治療肥胖的用途。TW1284149揭示副干酪乳桿菌CLa"o6ac〃/w/7"racos")GMNL-32及其治療過敏相關(guān)疾病的用途。另外,TW200611973揭示發(fā)酵乳桿菌(丄ac/o^cz'/Zi^/^we"/ww)GM-090能有效刺激IFN-y的分泌和/或治療過敏。此外,Jae-SeonSo等人報(bào)導(dǎo)干酪乳桿菌(/^cfo6ac〃/wcwe/)的口服施用會抑制膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(CIA)以及降低腳掌腫脹、淋巴細(xì)胞浸潤和軟骨組織的破壞。干酪乳桿菌通過004+T細(xì)胞降低II型膠原-反應(yīng)性促炎分子(IL-ip、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IFN-y、TNF-a以及Cox-2)。施用干酪乳桿菌也降低NF-kB向細(xì)胞核內(nèi)的移位以及CII-反應(yīng)性Thl-型IgG同種型IgG2a和IgG2b,同時上調(diào)免疫性IL陽10水平(Jae-SeonSo"a/.(2008),Mo/,/畫譜/.,45(9):2690-2699;Epub2008Feb19)。如果類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以通過服用乳桿菌分離株來達(dá)到治療效果,應(yīng)可為患者提供一用藥安全而且價格不貴的藥品。為達(dá)到這個目的,申請人從本土的成人胃腸道標(biāo)本中篩選出兩株乳桿菌分離株,它們在種系上(phylogenetically)是不同于各自所屬菌種中已公開的菌株,而且具有能夠刺激產(chǎn)生大量的IL-10以及較少量的IFN-Y和/或TNF-a的抗炎活性,因而被預(yù)期可用于治療與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病,包括但不限于,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
      發(fā)明內(nèi)容于是,在第一個方面,本發(fā)明提供一種具有抗炎活性的乳桿菌屬菌種(Za"o6a"7/wM.)的分離株,其中該分離株是(i)一選自于下列的保藏菌株(a)沙克乳桿菌GMNL-76,其以保藏編號BCRC910355被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207153被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;以及(b)羅伊氏乳桿菌GMNL-89,其以保藏編號BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;或(ii)在(i)項(xiàng)中的所述保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。在第二個方面,本發(fā)明提供一種食品產(chǎn)品,其包含有一如上所述的乳桿菌屬菌種的分離株以及一可食性材料。在第三個方面,本發(fā)明提供一種可用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物,其包含有一如上所述的乳桿菌屬菌種的分離株。在第四個方面,本發(fā)明提供一種用于治療個體的與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的方法,其包括對需要該治療的個體施用一如上所述的乳桿菌屬菌種的分離株。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明,所以本發(fā)明在上述以及其它目的與特征,可借由參照下文的描述、所附的權(quán)利要求書和附圖而變得更為明顯,附圖中圖1顯示患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠在經(jīng)連續(xù)喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89歷時8周之后被收集血清并進(jìn)行IL-10的ELISA試驗(yàn)的結(jié)果,其中不患有關(guān)節(jié)炎并被喂食以逆滲透水的大鼠以及患有關(guān)節(jié)炎但被喂食以逆滲透水的大鼠是分別作為對照組以及安慰劑組;圖2顯示患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠在經(jīng)連續(xù)喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89歷時8周之后被收集血清并進(jìn)行IFN-Y的ELISA試驗(yàn)的結(jié)果,其中不患有關(guān)節(jié)炎并被喂食以逆滲透水的大鼠以及患有關(guān)節(jié)炎但被喂食以逆滲透水的大鼠分別是作為對照組以及安慰劑組;圖3顯示患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠在經(jīng)連續(xù)喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89歷時8周之后被收集血清并進(jìn)行TNF-a的ELISA試驗(yàn)的結(jié)果,其中不患有關(guān)節(jié)炎并被喂食以逆滲透水的大鼠以及患有關(guān)節(jié)炎但被喂食以逆滲透水的大鼠是分別作為對照組以及安慰劑組;圖4顯示本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76的16SrDNA核苷酸序列;圖5顯示分別以本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及2株以往的沙克乳桿菌BCRC12933與BCRC17500的基因組DNA作為模板并使用LacP2引物進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)分析,繼而以1.8°/。瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后,于紫外光下觀察所得到的照相結(jié)果,其中在(A)區(qū)中,泳道M1:DNA梯(100-3000bp),泳道l:GMNL-76;在(B)區(qū)中,泳道M2:DNA梯(100-3000bp),泳道2:BCRC12933;以及在(C)區(qū)中,泳道M3:DNA梯(100-3000bp),泳道3:BCRC17500;圖6顯示本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89的16SrDNA核苷酸序列;以及圖7顯示分別以本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89以及5株以往的羅伊氏乳桿菌BCRC14625、BCRC16090、BCRC16091、BCRC17476與BCRC17478的基因組DNA作為模板并使用LacP2引物進(jìn)行RAPD分析,繼而以1.8%瓊脂糖凝膠來進(jìn)行電泳后,于紫外光下觀察所得到的照相結(jié)果,其中在(A)區(qū)中,泳道M1:DNA梯(100-3000bp),泳道l:GMNL-89;在(B)區(qū)中,泳道M2:DNA梯(100-3000bp),泳道2:BCRC14625;在(C)區(qū)中,泳道M3:DNA梯(100-3000bp),泳道3:BCRC16090;在(D)區(qū)中,泳道M4:DNA梯(100-3000bp),泳道4:BCRC16091;在(E)區(qū)中,泳道M5:DNA梯(100-3000bp),泳道5:BCRC17476;以及在(F)區(qū)中,泳道M6:DNA梯(100-3000bp),泳道6:BCRC17478。發(fā)明詳細(xì)說明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種全身性的慢性疾病,但目前臨床上所用的藥物并無法有效地治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,而且長期使用此類藥物還會引起非所需的不利副作用。此外,先前的研究指出與Thl細(xì)胞有關(guān)的促炎細(xì)胞因子(諸如IFN-Y以及TNF-a)會促進(jìn)炎癥而使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病況更為惡化,而與Th2細(xì)胞有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(諸如IL-10與IL-4)可以抑制促炎細(xì)胞因子的生成以及可通過誘導(dǎo)TIMP的生成來減少軟骨破壞。因此,本發(fā)明人推論類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療也許可以借由調(diào)控免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子以及促炎細(xì)胞因子的分泌量來達(dá)成。乳酸菌,特別是乳桿菌屬的菌株,是為人所熟悉與廣泛使用的益生性微生物,它們已被證實(shí)具有許多有益于宿主健康的功效,例如增進(jìn)腸道菌群的菌相平衡、預(yù)防腹瀉、降低結(jié)腸癌的危險(xiǎn)性、刺激胃腸上皮粘膜系統(tǒng)的正常發(fā)育與功能、產(chǎn)生各種維生素與營養(yǎng)素以及預(yù)防與治療陰道病等。因此,申請人嘗試從被視為是益生性微生物的乳酸菌當(dāng)中找出具有有利的抗炎活性的乳桿菌分離株以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。于是,申請人以來自臺灣健康成人的胃腸道標(biāo)本作為乳桿菌分離株的分離來源,并將所得到的分離株分別與實(shí)驗(yàn)動物的單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)以剌激單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,然后使用IL-10以及IFN-y作為篩選標(biāo)記,而篩選出能夠刺激單核細(xì)胞分泌大量的IL-10以及較少量的IFN-y和/或TNF-a的兩株乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89,它們經(jīng)特征鑒定被分別歸屬于沙克乳桿菌以及羅伊氏乳桿菌。沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89已分別于2007年6月14日以及2006年11月14日以保藏編號BCRC910355與BCRC910340被保藏于臺灣的食品工業(yè)發(fā)展研究所(FoodIndustryResearchandDevelopmentInstitute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BiosourceCollectionandResearchCenter,BCRC)(300新竹市食品路331號)。這兩個分離株也依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定,于2007年11月19日分別以保藏編號CCTCCM207153與CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(武漢,武漢大學(xué),430072,中華人民共和國)。當(dāng)本發(fā)明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89被喂食給患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠時,可觀察到大鼠血清中的IL-10升高而IFN-Y與TNF-a降低,這顯示本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89能夠使大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀況不再惡化。相比于以往菌株沙克乳桿菌BCRC12933與BCRC17500以及羅伊氏乳桿菌BCRC14625、BCRC16090、BCRC16091、BCRC17476與BCRC17478,沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89在活體外剌激單核細(xì)胞分泌IL-10的能力分別地要比它們各自所屬菌種的以往菌株更佳?;谏鲜龅挠欣锘钚?,本發(fā)明的兩株乳桿菌分離株或它們的繼代培養(yǎng)后代被預(yù)期具有可用于治療與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的潛力。于是,本發(fā)明提供一種用于治療與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物,其包含有(i)至少一種選自于下列的保藏菌株(a)沙克乳桿菌GMNL-76,其以保藏編號BCRC910355被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207153被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;以及(b)羅伊氏乳桿菌GMNL-89,其以保藏編號BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;或(ii)在(i)項(xiàng)中的該保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。本發(fā)明也提供一種用于治療個體的與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的方法,其包括對需要該治療的個體施用如上所述的乳桿菌屬分離株或其繼代培養(yǎng)后代。依據(jù)本發(fā)明,所述與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病是選自于下列所構(gòu)成的組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、脊椎炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎以及銀屑病(EvelineTrachsel"(2007),4〃/zr/〃si^search&772",,9(1):R9,Publishedonline2007January29.doi:10.1186/ar2115;SuchitaNadkarni"a/.(2007),7VeJowrw"/o/Med/c/"e,204:33-39;RichardOWilliams"a/.(2007),Cwrrewf(9pz'w/ow尸/arwaco/ogy,7:412-417)。在本發(fā)日月的一個優(yōu)選實(shí)施方式中,所述與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。依據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可利用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所詳知的技術(shù),將上述的乳桿菌分離株或其繼代培養(yǎng)后代配制于一藥學(xué)上可接受的載體中,然后制成適用于口服施用的劑型。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中,所述藥物組合物呈選自于下列一組中的劑型溶液、懸浮液、乳劑、粉末、片劑、丸劑、糖漿、錠劑、含錠、咀嚼膠、膠囊、膏劑以及類似物。如本文中所用的,術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意指一種當(dāng)被施用時不會在被施用個體內(nèi)造成過敏性反應(yīng)或其它非所需的效用的載體。依據(jù)本發(fā)明,所述藥學(xué)上可接受的載體可包含一或多種選自于下列的試劑溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、粘合劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑以及類似物。此外,本發(fā)明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89也被發(fā)現(xiàn)具有耐膽鹽與耐胃酸特性,因而適用于作為一種胃腸道益生菌。例如,這種分離株或其繼代培養(yǎng)后代可用作食品添加劑,經(jīng)現(xiàn)有的方法在原料制備時添加,或是不參與發(fā)酵而于發(fā)酵制作過程之后添加,而與任一種可食性材料被配制成供人類與非人類動物攝食的食品產(chǎn)品。因此,本發(fā)明也提供一種食品產(chǎn)品,其包含有一如上所述的乳桿菌分離株或其或其繼代培養(yǎng)后代以及一種可食性材料。適用于本發(fā)明的可食性材料包括但不限于液體乳制品,例如乳、濃縮乳;發(fā)酵乳,例如酸乳酪、酸乳、冷凍酸乳酪、乳酸菌發(fā)酵飲料;奶粉;冰淇淋;奶酪;干酪;豆?jié){;發(fā)酵豆?jié){;蔬果汁;果汁;運(yùn)動飲料;甜點(diǎn);果凍;糖果;嬰兒配方奶粉;保健食品;動物飼料;膳食補(bǔ)充劑等等。此外,依據(jù)本發(fā)明的食品產(chǎn)品可被制備成其中含有可直接食用的凍干或噴霧干燥菌體粉末的速溶沖泡食品的形式。有關(guān)食品產(chǎn)品的制備,可以參見,例如US6,872,565B2、US7,244,424B2、US7,270,994B2、US7,172,777B2以及US6,872,411Bl。依據(jù)本發(fā)明的食品產(chǎn)品可進(jìn)一步包含有至少一種益生性微生物。如本文中所用的"益生性微生物"或"益生菌"等術(shù)語可被相互交換使用,且意指活的微生物的制備物,當(dāng)被人類或動物攝食之后,所述微生物可以保持并存活在胃腸道之中,而且能夠提供疾病的預(yù)防與治療。適用于本發(fā)明的益生性微生物包括但不限于乳桿菌屬菌禾中(丄a"o6ac〃/ws雙歧桿菌屬菌禾中(丑(/VdoZm"eHww鏈球菌屬菌種OS&e;^oco"w^.)、酵母,以及它們的組合。優(yōu)選地,所述乳桿菌屬菌種是選自于下列所構(gòu)成的組嗜酸孚L桿菌(丄a"o6ac〃/wacWop/n71^)、乳酸乳桿菌(i:acfo6acz7/ws、瑞士乳桿菌(丄(3C/o6ac///^/ze/ve"CWJ)、短乳桿菌(Z^"o6(3c〃/ws6rev/"、干酪乳木干菌(丄ac^oZmc〃/w51case/)、植物乳豐干菌(Z^cfoZmc/〃MS;/(3W&廠wm)、唾$夜字L豐干菌(丄a"o6ac/〃M51sa/z.van'w"、雙歧學(xué)L木干菌(丄ac"Zac〃/ws6(/ydws)、〈呆力口禾U亞乳桿菌(丄a"o6acz7/t^Z^/gaWcws)、咼力口索乳桿菌(Z^"oZmc〃/ws)、鼠李糖乳豐干菌(丄a"o6ac〃/wsr/zam"osw"、力口氏乳桿菌(iLa"o6ac〃/wga^er/),以及它們的組合。優(yōu)選地,所述雙歧桿菌屬菌種是選自于下列所構(gòu)成的組兩歧雙歧桿菌C8(/^o6a"er/ww6(/i'dww)、長雙歧桿菌(5zy)Wo6a"e"'ww/owgww)、嬰乂L雙歧桿菌(5(/>'doZ>oc/eWwm/"/ow〃"、短雙歧桿菌(5(/Vdo6a"e"'MW6reve)、青春雙歧桿菌(5zyVJo6ac/eHMmado/escew〃s)、字L酸雙歧桿菌(5(/7do6a"eWwm/acf"),以及它們的組合。優(yōu)選地,所述鏈球菌屬菌種是選自于下列所構(gòu)成的組嗜熱鏈球菌(&,fococ園^7e,o//n7—、乳酸鏈球菌(5Vre/fococcMS/ac〃"、乳月旨鏈球菌(5Yre/fococcwscremo",s)、雙乙酷鏈球菌(;SVre;ococcMSWace0^ca"",以及它們的組合。優(yōu)選地,所述酵母是選自于下列所構(gòu)成的組乳酒假絲酵母(Ca"G^afa《ey3^)、弗羅棱糖酵母(/S"occ/"row少cej/7orew"V2WJ)、酉良、酒酵母OSacc/zfl廠om;;cescerev"eae),以及它們的纟且合。本發(fā)明將就下面實(shí)施例來作進(jìn)一步說明,但應(yīng)了解的是,該等實(shí)施例僅是用來作為例示說明,而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明的實(shí)施上的限制。實(shí)施例實(shí)施例l.具有抗炎活性的乳桿菌分離株的初步篩選實(shí)驗(yàn)夯辨與方法.-A.試驗(yàn)菌株的來源與制備申請人于91年2月經(jīng)由中國醫(yī)藥大學(xué)附設(shè)醫(yī)院(臺中市)取得眾多健康成人的胃腸道標(biāo)本,并從這些標(biāo)本中分離出4百余株的乳桿菌分離株。為尋找具有可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛力的益生菌,申請人對這些乳桿菌分離株進(jìn)行抗炎活性分析,并使用IL-10作為篩選標(biāo)記。將各試驗(yàn)菌株接種至Bacto乳桿菌MRS肉湯培養(yǎng)基(DIFCO,Cat.No.0881)內(nèi),然后于37°C下厭氧培養(yǎng)12至18小時。所形成的細(xì)菌培養(yǎng)物以4,000rpm離心15分鐘,倒除上清液,將沉淀物以1X磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌共計(jì)3次,然后懸浮于1XPBS中。所形成的菌液以1XPBS調(diào)整濃度至l5xl(^細(xì)胞/mL(以O(shè)D6oo進(jìn)行菌數(shù)計(jì)數(shù),OD6oo^l.OO二5.0xl()8細(xì)胞/mL),并以之作為原液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋,生成108、107、106、105、104、103、102、1(^細(xì)胞/mL的試驗(yàn)菌液供隨后的實(shí)驗(yàn)用。B.小鼠脾臟單核細(xì)胞的制備以C02處死68周齡的雌性BALB/c小鼠,取出脾臟并用經(jīng)滅菌的玻棒研磨。將研磨后的脾臟組織與Ficoll-PaqueTMPLUS(17-1441-03,AmershamBiosciences)以1:l的體積比進(jìn)行密度梯度離心(720gx20min,在4。C下)。之后,移除紅血球,將由此得到的小鼠脾臟單核細(xì)胞以含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4xl()S細(xì)胞/mL備用。C.乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的評估向96孔的培養(yǎng)盤的各孔加入100^L的上述B中所制備的小鼠脾臟單核細(xì)胞樣品,并分成3組分別加入(l)試驗(yàn)組,20pL的上述A項(xiàng)中所制備的試驗(yàn)菌液(lxlO細(xì)胞/mL);(2)正常對照組,20nL的含有10。/。FBS的RPMI1640培養(yǎng)基;以及(3)陽性對照組,20iiL的脂多醣(LPS)(大腸桿菌C^c/zeWc/n'aco/Z)血清型055:B5,Sigma)。在培養(yǎng)箱(37T:,5%C02)中進(jìn)行培養(yǎng)歷時24小時之后,將各孔內(nèi)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心,并從所收獲的上清液取出100^L進(jìn)行使用MouseIL-10OptEIATMSet(BDBiosciences,Cat.No.555252)的酵聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。將各組的實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。IL-10的濃度是借由將ELISA試驗(yàn)所測得的OD4Q5數(shù)值代入下列公式進(jìn)行計(jì)算,并以ELISA單位(%)來表示£1^18八單位(%)=[(A—C)/(B—C)xl00其中A^乳桿菌分離株的OD405數(shù)值B二陽性對照組的OD405數(shù)值C=正常對照組的OD4Q5數(shù)值在所有的試驗(yàn)菌株當(dāng)中,有46株會刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌較高數(shù)量的IL-10,它們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表l中。表l.乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的功效評估<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>根據(jù)表l所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并同時考慮這46株試驗(yàn)菌株的生長速度、菌數(shù)以及在產(chǎn)量上的實(shí)用性等因素后,申請人選出GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161來作進(jìn)一步試驗(yàn),以評估它們在刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10與IFN-Y上的能力。實(shí)施例2.乳桿菌分離株刺激人PBMC分泌IL-10與IFN-Y能力的評估實(shí)驗(yàn)裙賴與方法.-A.人外周血單個核細(xì)胞的制備取經(jīng)檢驗(yàn)合格供實(shí)驗(yàn)用的人白細(xì)胞濃縮液(臺南捐血中心)與Ficoll-PaqueTMPLUS(17-1441-03,AmershamBiosciences)以1:1的體積比進(jìn)行密度梯度離心(720gx20min,在4。C下)。之后,移除紅血球,將由此得到的人PBMC以含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4xl()e細(xì)胞/mL備用。B.乳桿菌分離株剌激人PBMC分泌IL-10的評估乳桿菌分離株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人PBMC分泌IL-10的能力大體上是參照實(shí)施例l的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的C"乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的評估,,當(dāng)中所述的操作程序來作評估,不同之處在于以20(iL的濃度為lxl0S細(xì)胞/mL的試驗(yàn)菌液作為試驗(yàn)組,并且使用IOOjiL的上述A項(xiàng)中所制備的人PBMC樣品以及HumanIL-10OptEIATMSet(BDBiosciences,Cat.No.555157)。C.乳桿菌分離株剌激人PBMC分泌IFN-y的評估乳桿菌分離株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人PBMC分泌IFN-y的能力是依照下面所述來作分析。向96孔的培養(yǎng)盤的各孔加入100pL的上述A中所制備的人PBMC樣品,并分成兩組分別加入(l)試驗(yàn)組,20pL的實(shí)施例l的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的A"試驗(yàn)菌株的來源與制備"當(dāng)中所制備的試驗(yàn)菌液(lxl(^細(xì)胞/mL);以及(2)正常對照組,20^L的含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱(37。C,5%002)中培養(yǎng)24小時之后,將各孔內(nèi)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心,并從所收獲的上清液取出IOOpL進(jìn)行使用BDOptEIATMHumanIFN-yELISAKitII(BDBiosciences,Cat.No.550612)的IFN-yELISA。另外,將人PBMC樣品以4xl(^細(xì)胞/mL添加10)ng/mL菜豆凝集素(PHA)(Sigma,Cat.No.L2769)的比例進(jìn)行共同培養(yǎng)歷時48小時。離心(720gx20min,在4'C下)之后,將上清液分裝保存于-80。C冰箱備用。當(dāng)進(jìn)行IFNiELISA分析時,將該經(jīng)過PHA處理的上清液(100|uL)用作內(nèi)陽性對照組(internalpositivecontrol)。以微量分注器將經(jīng)過包被緩沖液(O.lMNa2HP04,0.77mMNaN3,pH9.0)予以稀釋1000倍的100小鼠抗人IFN-y(BDPharmingenTM,Cat.No.551221)加入至一個96孔的培養(yǎng)盤(Nunc-ImmunoTM96MicroWellTMPlates,MaxiSorp,Cat.No.442404)的各孔中,于室溫(25'C)下以40rpm振蕩該培養(yǎng)盤歷時l小時,然后將該培養(yǎng)盤置于4。C下過夜。之后,將該培養(yǎng)盤回溫并移除各孔中的液體,然后以洗滌緩沖液(含有0.05%Tween20的PBS)洗滌各孔2次(每次3分鐘),繼而向每孔內(nèi)加入200^L的封閉緩沖液(含有3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS),并靜置于室溫下歷時2小時,隨后移除封閉緩沖液并用洗滌緩沖液洗滌2次。將IOOpL的待測樣品加入各孔中,并于4'C下反應(yīng)過夜。之后,移除各孔中的液體,以洗滌緩沖液洗滌2次,然后將經(jīng)過稀釋緩沖液(含有1%BSA的PBS)予以稀釋2000倍的100^tL生物素小鼠抗隱人IFN-y(BDPharmingen,Cat.No.554550)力口入至各孑L內(nèi),并于室溫下反應(yīng)歷時2小時。以洗滌緩沖液洗滌2次之后,加入經(jīng)過稀釋緩沖液稀釋2000倍的100pL抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶(Streptavidin-AP,BDPharmingenTM,Cat.No.554065),并于室溫下反應(yīng)歷時l小時。在移除各孔中的液體之后,以洗滌緩沖液洗滌4次,然后將IOOfiL新鮮配制的對硝基苯酚磷酸鹽(pNPP)溶液加入至各孔中。于室溫下將培養(yǎng)盤置于暗處以進(jìn)行顯色反應(yīng)歷時30分鐘。之后,用ELISAMicroplateReader(Bio-Rad,Model550)讀取各孔在波長405nm下的吸光值(OD4Q5)。將各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。IFN-y的濃度是借由將ELISA試驗(yàn)所測得的OD4。5數(shù)值代入下列公式進(jìn)行計(jì)算,并以ELISA單位(%)來表示£118八單位(%)=[(A—C)/(B—C)xl00其中A二乳桿菌分離株的OD405數(shù)值B=內(nèi)陽性對照組的OD405數(shù)值C二正常對照組的OD4。5數(shù)值乳桿菌分離株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10與IFNi的結(jié)果被分別示于表2與表3中。表2.乳桿菌分離株刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表3.乳桿菌分離株刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>從表2可見,在所有的乳桿菌分離株中,乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10的數(shù)量最高,這顯示這兩個分離株對于刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10的能力是最佳的。另從表3可見,在所有的乳桿菌分離株中,乳桿菌分離株GMNL-78刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IFN-y的數(shù)量最低,而GMNL-89以及GMNL-76次之,這顯示乳桿菌分離株GMNL-78對于刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IFN-Y的能力是最差的,而乳桿菌分離株GMNL-89以及GMNL-76對于刺激人外周血單個核細(xì)胞分泌IFN-Y的能力也是較差的。己知促炎細(xì)胞因子(諸如IFN-y與TNF-a)會促進(jìn)炎癥而使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病況更為惡化,而免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(諸如IL-10)可以抑制促炎細(xì)胞因子的生成。申請人據(jù)此而推論若能夠剌激人類或動物的單核細(xì)胞分泌較多的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子以及較少的促炎細(xì)胞因子,應(yīng)會有利于改善患有RA的人類或動物的病況。而根據(jù)表2與表3所示的結(jié)果,申請人認(rèn)為乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89是最具開發(fā)潛力的菌株,并以之來進(jìn)行下面的動物試驗(yàn)。實(shí)施例3.乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89對于帶有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠的治療效用評估實(shí)驗(yàn)#辨與方法.-A.實(shí)驗(yàn)動物將得自國家實(shí)驗(yàn)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心(NationalAppliedResearchLaboratoriesNationalLaboratoryAnimalCenter)的雄性LEW/SsNNarl大鼠(6周齡,體重為大約200至250g)用于下面的實(shí)驗(yàn)中。所有的實(shí)驗(yàn)動物被飼養(yǎng)于一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在25±1°C以及濕度維持在60±5%的獨(dú)立空調(diào)的動物房內(nèi),而且水分與飼料被充分地供給。給予動物一周時間適應(yīng)環(huán)境,待動物穩(wěn)定之后才開始進(jìn)行試驗(yàn)。有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的處理以及一切實(shí)驗(yàn)程序均依據(jù)實(shí)驗(yàn)動物委員會的標(biāo)準(zhǔn)章程規(guī)范來進(jìn)行。B.試驗(yàn)菌株的制備將乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89分別接種于Bacto乳桿菌MRS肉湯培養(yǎng)基(DIFCO,Cat.No.Q881)中,于37。C下厭氧培養(yǎng)至飽和生長狀態(tài)。以3,000g離心15分鐘之后,將沉淀物分別用2mL與lmL的lXPBS(pH7.2)洗滌2次,然后加入lmL的PBS,并于OD6。。測量菌液濃度,結(jié)果均達(dá)1.0xl0"細(xì)胞/mL左右。將菌液(1XPBS)冷凍保存于-80"C下備用。C.關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)有關(guān)關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)是參考Y.KameyamaW(2004),5owe,35:948-956當(dāng)中所述的方法來進(jìn)行,并略作修改。將牛II型膠原(簡稱CII)(Sigma-Aldrich,Cat.No.C1188)溶于0.05M醋酸溶液中以配制具有濃度為2mg/mL的CII溶液。以IOO(iL的CII溶液添加IOO^L的完全弗氏佐劑(CFA)的方式配制CII乳化液。之后,將200)iL的CII乳化液皮下注射至大鼠尾巴內(nèi)進(jìn)行初始免疫,并于免疫21天后再加強(qiáng)免疫一次。D.乳桿菌分離株的喂食將大鼠隨機(jī)地分成4組(每組n二6),其中包括3個實(shí)驗(yàn)組(GMNL-76組、GMNL-89組與安慰劑組)以及一個對照組。除了對照組之外,其它各組的大鼠均依照上述C"關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)"當(dāng)中所述的方法誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。對于GMNL-76組以及GMNL-89組,從加強(qiáng)免疫后的第7天起,給大鼠喂食上述B"試驗(yàn)菌株的制備"當(dāng)中所制備的菌液(1.0xlO"細(xì)胞/mL/天)。至于安慰劑組以及對照組的大鼠,喂食逆滲透水。在連續(xù)喂食8周之后,通過眼采血收集大鼠的血液并進(jìn)行離心,將由此得到的血清用于測定IL-10、IFN-Y以及TNF-a的濃度。另外,將經(jīng)眼采血的各組大鼠進(jìn)一步用于進(jìn)行下面的關(guān)節(jié)炎評估。E.IL-IO、IFN-Y以及TNF-a的濃度測定IL-10的濃度測定大體上是參照實(shí)施例1的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的C"乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的評估"當(dāng)中所述的操作程序來作評估,但是使用上面D中所得到的大鼠血、凊以及RatIL曙IOOptEIATMSet(BDBiosciencePharMingen,SanDiego,CA,Cat.No.2611KI)。IFN-y的濃度測定大體上是參照實(shí)施例2的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的C"乳桿菌分離株刺激人類PBMCs分泌IFN-Y的評估"當(dāng)中所述的操作程序來作評估,但是使用上面D中所得到的大鼠血清以及RatIFN畫yOptEIATMSet(BDBiosciencePharMingen,SanDiego,CA)。TNF-a的濃度測定大體上是參照實(shí)施例1的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的C"乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-IO的評估"當(dāng)中所述的操作程序來作評估,但是使用上面D中所得到的大鼠血、凊以及BDOptEIARatTNF誦aELISAKit(BDBiosciencePharMingen,SanDiego,CA)。由此所測得的OD405數(shù)值進(jìn)而分別根據(jù)預(yù)先以具有不同己知濃度的IL-IO、IFN-Y或TNF-a標(biāo)準(zhǔn)品相對于它們自身的004()5數(shù)值所作出的相關(guān)曲線(correlationcurve)而換算成濃度(pg/mL)來表不。f.關(guān)節(jié)炎的評估將經(jīng)眼采血的各組大鼠用于進(jìn)行下面的關(guān)節(jié)炎評估,而有關(guān)大鼠的關(guān)節(jié)炎評估是參照Y.Kameyamawa/.(2004),35:948-956當(dāng)中所述的方法來進(jìn)行。簡略地來說,記錄大鼠的四只腳掌關(guān)節(jié)的紅腫、脹大等變化情形,并以下列5種計(jì)分作為區(qū)別的依據(jù)計(jì)分0,未表現(xiàn)任何關(guān)節(jié)炎癥狀;計(jì)分l,有l(wèi)個腳趾腫脹;計(jì)分2,有3個以上的腳趾腫脹;計(jì)分3,整個腳掌腫脹;以及計(jì)分4,所有的關(guān)節(jié)均嚴(yán)重腫脹,無法正常行走而呈蜷縮狀。g.統(tǒng)計(jì)分析方法本實(shí)施例采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(10.0版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于實(shí)驗(yàn)動物的總樣本數(shù)少于30,所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是以無母數(shù)統(tǒng)計(jì)方法(nonparametricstatisticalmethods)(也稱為曼-惠特尼U檢驗(yàn)(Mann-WhitneyUtest))進(jìn)行分析,以評估對照組、GMNL-76組以及GMNL-89組分別與安慰劑組之間在樣本分布上的差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是以平均值士偏差值來表示(統(tǒng)計(jì)顯著性,P<0.05)。各組大鼠在歷經(jīng)連續(xù)8周的喂食后,血清中的IL-IO、IFN-Y以及TNF-a的濃度被分別顯示于表4以及圖l至圖3中。另外,關(guān)節(jié)炎評估的計(jì)分結(jié)果也被歸納于表4中。表4.歷經(jīng)連續(xù)8周的喂食后,各組大鼠血清中的IL-IO、IFN-與TNF-a的濃度以及關(guān)節(jié)炎評估的計(jì)分結(jié)果分析項(xiàng)目對照組安慰劑組GMNL-76GMNL-89IL-10(pg/mL)4.56±5.506.22±4.81111.78±3.74712.44±5.232IFN-y(pg/m10復(fù)60±4.24346.78士52.6412.20±10.92325.00±26.482TNF匿a(pg/mL)3.32士1.757"1539.80±1.9989.44±3.988*12.20±6.643*關(guān)節(jié)炎程度的計(jì)分0*12.333±1.15511.67±2.56313.42±2.1551:所有的數(shù)據(jù)是以曼-惠特尼u檢驗(yàn)進(jìn)行分析。2:關(guān)節(jié)炎程度的計(jì)分是以大鼠四只腳掌關(guān)節(jié)的計(jì)分總和來表示。3:*表示?<0.05,與安慰劑組相比較。從表4以及圖1至圖3可見,GMNL-76組與GMNL-89組的大鼠在分別喂食乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89后,牠們血清中的IFN-Y以及TNF-a濃度相較于安慰劑組有顯著的降低,而IL-IO濃度則有顯著的增加。因此,申請人推論乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89除了能夠降低Thl細(xì)胞所分泌的IFN-y以減輕炎癥現(xiàn)象外,也可以降低TNF-a的分泌量,進(jìn)而減少基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌量,使得關(guān)節(jié)組織中的軟骨不會再繼續(xù)受到破壞。另外,乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89也能提高免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10的分泌量,而讓炎癥的情況受到控制。因此,雖然關(guān)節(jié)炎所造成的關(guān)節(jié)損害已無法逆轉(zhuǎn),但是通過喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89,在大鼠的血清中,與炎癥相關(guān)聯(lián)的IFN-y以及TNF-(x已有降低的情形,而與抗炎相關(guān)聯(lián)的IL-10則有上升的情形,這表示大鼠的關(guān)節(jié)炎病況能夠獲得減輕并且不再繼續(xù)惡化。實(shí)施例4.乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89的特征鑒定為了確認(rèn)在上面實(shí)施例中所篩選出的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89所屬菌種,進(jìn)行下面的初步試驗(yàn)、16SrDNA序列分析以及隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA分析。,驗(yàn)教^與方法;A.初步試驗(yàn)對乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89進(jìn)行初步試驗(yàn),試驗(yàn)項(xiàng)目包括革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)觀察、過氧化氫酶反應(yīng)、運(yùn)動性(mobility)、在好氧與厭氧條件下的生長情況等試驗(yàn)。B.16SrDNA序列分析于無菌條件下,將乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89分別接種于lmL的Bacto乳桿菌MRS肉湯培養(yǎng)基(DIFCO,Cat.No.0881)中,并于37-C下培養(yǎng)過夜。之后,將菌液以13,000rpm進(jìn)行離心歷時l分鐘,繼而移除上清液。向留下的沉淀物加入200的ddH20以充分懸浮菌體,以13,000rpm進(jìn)行離心歷時l分鐘之后移除上清液,并重復(fù)此步驟l次。最后,以200ddH20懸浮經(jīng)離心而得到的沉淀物,其中含有所述乳桿菌分離株的基因組DNA。以所得到的基因組DNA作為模版并使用一組被發(fā)表于P.S.M.Yeimg"a/.(2002),丄D"z>jk5"cz'.,85:1039-1051中的牽十對乳桿菌的16SrDNA而設(shè)計(jì)的具有下面所示核苷酸序列的引物對PAF引物與536R引物,使用下面表5中所示的反應(yīng)條件進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。PAF弓1物5'-agagtttgatcctggctcag-3,(SEQIDNO:1)536R弓l物5,-gtattaccgcggctgctg-3,(SEQIDNO:2)表5.PCR的反應(yīng)條件內(nèi)容物體積&L)乳桿菌分離株的基因組DNA0.5PAF引物(IOpM)1536R弓l物(IOnM)1dNTP(2.5mM)110X五xn^緩沖液(TaKaRa)r"〖ai^£xr"《(TaKaRa)(5U/|iL)0.2水41.3操作條件在94'C下進(jìn)行變性反應(yīng)歷時30秒、在5TC下進(jìn)行引物退火歷時30秒、在72'C下進(jìn)行延長反應(yīng)歷吋30秒,共進(jìn)行30個循環(huán)。完成PCR之后,通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)是否得到一大小約為500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并從凝膠回收純化該經(jīng)確認(rèn)的PCR產(chǎn)物。該經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物是委托基龍米克斯生物科技股份有限公司(臺灣)進(jìn)行測序,所得到的測序結(jié)果利用NCBI網(wǎng)站中的核苷酸-核苷酸BLAST軟件進(jìn)行比對分析。C.隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA分析在以16SrDNA序列分析確認(rèn)乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89所屬菌種之后,以上述B中所得到的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89的基因組DNA作為模版,并選用一個發(fā)表于M,DEANGELIS"a/.(2001),五wv/n5函e由/M/c"力/o/ogy,67:2011-2020中的具有下面所示核苷酸序列的10-mer引物L(fēng)acP2,使用下面表6中所示的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。LacP2弓l物5,陽atgtaacgcc-3,(SEQIDNO:3)表6.PCR的反應(yīng)條件內(nèi)容物體積&L)乳桿菌分離株的基因組DNA1LacP2弓l物(IOpM)0.5dNTP(2.5mM)0.510X五x7b《緩沖液(TaKaRa)2.57bi^7fl£x7bgTM(TaKaRa)(5U/pL)0.2水20.3操作條件在93"C下進(jìn)行變性反應(yīng)歷時1分鐘、在36'C下進(jìn)行引物退火歷時1分鐘、在74'C下進(jìn)行延長反應(yīng)歷時1分鐘,共進(jìn)行35個循環(huán)。完成PCR之后,擴(kuò)增產(chǎn)物以1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,繼而染色,然后于紫外光下進(jìn)行觀察并照相。在這個實(shí)驗(yàn)中,同時使用購自于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)的7株乳桿菌菌株作為比較菌株來進(jìn)行比對分析,它們分別為1.沙克乳桿菌沙克亞禾中(Za"o6ac〃/wss"A:ez's"&;.sa&z.)BCRC12933(對應(yīng)于ATCC31063,分離來源為酸菜);2.沙克乳桿菌肉質(zhì)亞禾中(丄""o6"c〃/wssaA:e/sw6s/.ca;-"osws)BCRC17500(對應(yīng)于LMG17302,分離來源為生香腸);3.羅伊氏乳桿菌(丄a"o6(3c"/MSBCRC14625(對應(yīng)于ATCC23272與DSM20016,分離來源為人類糞便);4.羅伊氏乳桿菌(Lacfo6aci'〃MSreWerOBCRC16090(對應(yīng)于DSM20015,分離來源為糞肥(manure);5.羅伊氏乳桿菌(L""o6acz7/"sBCRC16091(對應(yīng)于DSM20053,分離來源為人類糞便);6.羅伊氏乳桿菌(i:a"oZ)ac〃/w;yrew&W)BCRC17476(對應(yīng)于JCM1081,分離來源為雞腸);以及7.羅伊氏乳桿菌(丄""oZmc"/ws"w&W)BCRC17478(對應(yīng)于JCM2762,分離來源為發(fā)酵的糖蜜fermentedmolasses)。1.乳桿菌分離株GMNL-76的特征鑒定(i)依據(jù)初步試驗(yàn)結(jié)果,此分離株為革蘭氏陽性桿菌,不具運(yùn)動性,不具過氧化氫酶,不具氧化酶,于好氧及厭氧環(huán)境下均可生長;(ii)此分離株的16SrDNA序列分析結(jié)果示于圖4中,而經(jīng)與NCBI網(wǎng)站中的基因數(shù)據(jù)庫比對后,發(fā)現(xiàn)此分離株的16SrDNA序列(SEQIDNO:4)與沙克乳桿菌的16SrDNA的序列相似度最高;以及(iii)此分離株的RAPD分析結(jié)果示于圖5中。從圖5可見,此分離株的PCR產(chǎn)物的基因指紋圖譜與另外2株以往的沙克乳桿菌菌株所具有的基因指紋圖譜不相同。綜合以上鑒定結(jié)果,本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76被認(rèn)為是一株新的沙克乳桿菌分離株。2.乳桿菌分離株GMNL-89的特征鑒定(i)依據(jù)初步試驗(yàn)結(jié)果,此分離株為革蘭氏陽性桿菌,不具運(yùn)動性,不具過氧化氫酶,不具氧化酶,于好氧及厭氧環(huán)境下均可生長;(ii)此分離株的16SrDNA序列分析結(jié)果示于圖6中,而經(jīng)與NCBI網(wǎng)站中的基因數(shù)據(jù)庫比對后,發(fā)現(xiàn)此分離株的16SrDNA序列(SEQIDNO:5)與羅伊氏乳桿菌的16SrDNA序列相似度最高;以及(iii)此分離株的RAPD分析結(jié)果示于圖7中。從圖7可見,此分離株的PCR產(chǎn)物的基因指紋圖譜與另夕卜5株以往的羅伊氏乳桿菌菌株所具有的基因指紋圖譜不相同。綜合以上鑒定結(jié)果,本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89被認(rèn)為是一株新的羅伊氏乳桿菌分離株。本發(fā)明的沙克乳桿菌(/^"oZ)a"7/wm&")GMNL-76與羅伊氏孚L木千菌(Za"oZmcz7/z^GMNL-89己分另U于公元2007年6月14日以及2006年11月14日以保藏編號BCRC910355以及BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)(3OO新竹市食品路331號)。這兩個分離株也依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定,于2007年11月19日分別以保藏編號CCTCCM207153與CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(武漢,武漢大學(xué),430072,中華人民共和國)。實(shí)施例5.乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89與以往菌株在刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10能力的評估為了證明能夠刺激單核細(xì)胞分泌較多的IL-10是乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89所特有的生物活性,在下面的實(shí)施例中,將它們用于與7株以往菌株(也就是購自于食品工業(yè)發(fā)展研究所的沙克乳桿菌BCRC12933與BCRC17500以及羅伊氏乳桿菌BCRC14625、BCRC16090、BCRC16091、BCRC17476與BCRC17478)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)裙辨與方法.-IL-10的濃度測定大體上是參照實(shí)施例1的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的C"乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的評估"當(dāng)中所述的操作程序來作評估,并使用本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89以及上述的7株以往菌株來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由此所測得的OD405數(shù)值進(jìn)而分別根據(jù)預(yù)先以具有不同已知濃度的IL-10標(biāo)準(zhǔn)品相對于它們自身的OD4()5數(shù)值所作出的相關(guān)曲線而換算成濃度(pg/mL)來表示。將各菌株的實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±偏差值表示。翁榮下面的表7顯示GMNL-76、GMNL-89以及各比較菌株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的結(jié)果。表7.乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89以及比較菌株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的功效評估<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>從表7可見,在所有的試驗(yàn)菌株當(dāng)中,以本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89與以往菌株BCRC17476對于剌激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的能力最佳,而GMNL-76次之。表7所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次地證明本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89以及GMNL-76與它們各自所屬菌種的以往菌株是不相同的。實(shí)施例6.沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89的耐酸性以及膽汁酸鹽耐量試驗(yàn)為確認(rèn)本發(fā)明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89在攝食之后是否能夠通過消化道的嚴(yán)苛條件而存活下來,進(jìn)行一個模擬人類消化道的連續(xù)消化處理的實(shí)驗(yàn)。1.MRS肉湯培養(yǎng)基(pH二3):將55g的MRS粉末(BD,Cat.No.288130)溶于1L的逆滲透水中并予以充分混合,接著用lMHCl將pH值調(diào)整至3,繼而于12TC下進(jìn)行滅菌歷時15分鐘,待冷卻之后備用。2.含有0.2%(w/v)牛膽汁的MRS肉湯培養(yǎng)基將55g的MRS粉末溶于lL的逆滲透水中并予以充分混合,繼而于12TC下進(jìn)行滅菌歷時15分鐘。之后,待溫度降至大約45°C,加入2g的牛膽汁粉末(oxgallpowder,Sigma)并予以充分混合以得到一含有0.2%(w/v)牛膽汁的MRS肉湯培養(yǎng)基,繼而以一孔徑為0.45jxm的過濾膜予以過濾后備用。3.MRS瓊脂培養(yǎng)盤將55g的MRS粉末溶于lL的逆滲透水中,待完全溶解之后加入15g的瓊脂糖粉末,然后將所形成的混合物倒入至lL的血清瓶中并于12rC下進(jìn)行滅菌歷時15分鐘。之后,待溫度降至45°C,在無菌操作條件下,將大約15至20mL的MRS瓊脂溶液加入至各個無菌培養(yǎng)皿中,待冷卻凝固之后備用。實(shí)教方法.-A.耐酸性試驗(yàn)將3mL的于實(shí)施例l的"實(shí)驗(yàn)材料與方法"的A"試驗(yàn)菌株的來源與制備"當(dāng)中所得到的試驗(yàn)菌液接種至27mL的MRS肉湯培養(yǎng)基(pH二3)中并充分混合,接而將所形成的培養(yǎng)物置于37'C下培養(yǎng)歷時3小時。之后,取出1mL的培養(yǎng)物并以滅菌水進(jìn)行系列稀釋涂盤(10'9~10")以檢測存活的菌數(shù)。B.膽汁酸鹽耐量試驗(yàn)于上述A項(xiàng)的耐酸性試驗(yàn)結(jié)束后,將剩余的29mL培養(yǎng)物以4,000rpm離心歷時15分鐘,移除上清液并加入30mL無菌水懸浮菌體。之后,以4,000rpm離心歷時15分鐘并移除上清液,借此洗除酸性的MRS肉湯培養(yǎng)基。之后,加入30mL的含有0.2。/。(w/v)牛膽汁的MRS肉湯培養(yǎng)基以懸浮菌體,繼而將所形成的培養(yǎng)物置于37'C下培養(yǎng)歷時3小時。之后,取出lmL的培養(yǎng)物并以滅菌水進(jìn)行系列稀釋涂盤(1(T、10")以檢測存活的菌數(shù)。沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89在經(jīng)過模擬人類消化道的連續(xù)消化處理后的生長情況被顯示于下面的表8中。表8.沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89在經(jīng)過模擬人類消化道的連續(xù)消化處理后的生長情況乳桿菌分離株編號菌液的細(xì)胞濃度(CFU/mL)處理前以MRS肉湯培養(yǎng)基(pH二3)培養(yǎng)歷時3小時以含0.2%牛膽汁的MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)歷時3小時*GMNL-763.76x1086.3xl05GMNL-896.83xl081.2x109*:分離株已預(yù)先以MRS肉湯培養(yǎng)基(pH二3)培養(yǎng)歷時3小時。從表8可見,當(dāng)以pH二3的MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的兩株乳桿菌分離株歷時3小時之后,沙克乳桿菌GMNL-76的活菌數(shù)相較于處理前下降達(dá)大約99.95%,而羅伊氏乳桿菌GMNL-89的活菌數(shù)下降達(dá)大約64%。接著,這兩個乳桿菌分離株在含有0.2%牛膽汁的MRS肉湯培養(yǎng)基中被培養(yǎng)歷時另外3小時之后,活菌數(shù)并沒有下降的現(xiàn)象,兩者的存活率均極為優(yōu)越。這個結(jié)果顯示沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89能夠克服人類消化道的環(huán)境壓力,在攝食后能有效到達(dá)腸內(nèi)并定殖于腸內(nèi)。本案說明書中引述的所有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)以及專利文獻(xiàn)以它們的整體被并入本案作為參考數(shù)據(jù)。若有所沖突時,本案的詳細(xì)說明(包含界定在內(nèi))將占上風(fēng)。雖然本發(fā)明已參考上述特定的實(shí)施例進(jìn)行描述,顯然在不背離本發(fā)明的范圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發(fā)明僅受如權(quán)利要求書所示范圍的限制。序列表<110>景岳生物科技股份有限公司<120>具有抗炎活性的乳桿菌分離株及其用途<130>GMNL-76ANDGMNL-89<160>5<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>artificial<220><223>PAFprimerforPCRamplificationof16SrDNAofLactobacillus<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>18<212>DNA<213>artificial<220><223>536RprimerforPCRamplificationof16SrDNAofLactobacillus<400>2gtattaccgcggctgctg18<210>3<211>10<212>DNA<213>artificial<220><223>10-merprimerforPCRamplificationofgeneofLactobacillus<400>3atgtaacgcc10<210>4<211>535<212>DNA<213>LactobacillussakeiGMNL-76<400>4gggggggggtgctatacatgcaagtcgaacgcactctcgtttagattgaaggagcttgct60cctgattgataaacatttgagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcc120ctaaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcataaaacctaacaccgca180tggtgtagggttgaaagatggtttcggctatcactttaggatggacccgcggtgcattag240ttagttggtgaggtaaaggctcaccaagaccgtgatgcatagccgacctgagagggta^5Lt300cggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag360tcca_csa_tggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatc420gtaaaactctgttgttggagsagaatgta_tctgatagtaactgatcaggtagtgacggta480tccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgggggtaatac535<210>5<211>522<212>DNA<213>LactobacillusreuteriG麗!L-89<400>5ggcttgggataccgtcactgcgtgaacagttactctcacgcacgttcttc60gagctttacgagccgaaaccCttCttC5LCtcacgcggtgttgctccatcaggcttgcgcc120cattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtatggaccgtgtctcagttcca180ttgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagccgttacctt240a_ccaa_ctagctaatgcaccgcaggtccatcccagagtgatagccaaagccatctttcaaa300gtggcttttgttgttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatccc360ccgctccggggcaggttacctacgtgttactcacccgtccgccactcactggtgatccat420cgtcaatcaggtgcaagcaccatcaatcagttgggccagtgcgtacgacttgcatgtatt480aggcacaccgccggcgttcatcctgagccagaacgaactctc52權(quán)利要求1.一種具有抗炎活性的乳桿菌屬菌種(Lactobacillussp.)的分離株,其特征在于該乳桿菌屬菌種的分離株是(i)一種選自于下列的保藏菌株(a)沙克乳桿菌(Lactobacillussakei)GMNL-76,其以保藏編號BCRC910355被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207153被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;以及(b)羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-89,其以保藏編號BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;或(ii)在(i)項(xiàng)中的所述保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。2.—種可用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物,其特征在于該藥物組合物包含有(i)至少一種選自于下列的保藏菌株(a)沙克乳桿菌GMNL-76,其以保藏編號BCRC910355被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207153被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;以及(b)羅伊氏乳桿菌GMNL-89,其以保藏編號BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心,以及以保藏編號CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;或(ii)在(i)項(xiàng)中的所述保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。3.如權(quán)利要求2的藥物組合物,其特征在于所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。4.如權(quán)利要求2的藥物組合物,其特征在于該藥物組合物呈可供口服施用的劑型。5.如權(quán)利要求4的藥物組合物,其特征在于所述劑型選自下列所構(gòu)成的組溶液、懸浮液、乳劑、粉末、片劑、丸劑、糖漿、錠劑、含錠、咀嚼膠、膏劑以及膠囊。6.根據(jù)權(quán)利要求l的乳桿菌屬菌種的分離株,在制備用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物中的用途。7.如權(quán)利要求6的用途,其特征在于所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。8.如權(quán)利要求6的用途,其特征在于所述藥物組合物呈可供口服施用的劑型。9.如權(quán)利要求8的用途,其特征在于該劑型選自于下列所構(gòu)成的組溶液、懸浮液、乳劑、粉末、片劑、丸劑、糖漿、錠劑、含錠、咀嚼膠、膏劑以及膠囊。10.—種食品產(chǎn)品,其特征在于該食品產(chǎn)品包含有一如權(quán)利要求l的乳桿菌屬菌種的分離株以及一種可食性材料。11.如權(quán)利要求10的食品產(chǎn)品,其特征在于該食品產(chǎn)品進(jìn)一步包含有至少一種選自于下列一組中的益生性微生物乳桿菌屬菌種(丄flC"^"http://^^7.)、雙歧桿菌屬菌種(丑(/7t/o6a"en.Mms尸.)、鏈球菌屬菌禾中(5V"/^ococcws酵母,以及它們的組合。12.如權(quán)利要求ll的食品產(chǎn)品,其特征在于該乳桿菌屬菌種選自于下列所構(gòu)成的組嗜酸乳桿菌(Z^"o6ocz7/mjoc/t/o//n7w"、乳酸乳桿菌(丄a"o6ac〃/i/s/a"/"、瑞士乳桿菌(丄acfo6a"7/ws/^/vef/cws)、短孚L桿菌(丄ac/o6acz7/w6rev")、干酪乳桿菌(丄a"o6ac〃/wcase/)、植物孚L桿菌(丄a"oZ)。c〃/i^p/awfarww)、唾液孚L桿菌(Z/a"o6ac〃/wssa〃van'ws)、雙歧乳桿菌(丄(3"o6a"'〃Ms6(/Vc/ws)、保力B禾lj亞乳桿菌(丄acfo6ac〃/ws6w/gar〖cws)、高力口索孚L桿菌(丄a"oZmc〃/wscawcasz'cws)、鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac〃/wsW2amw0sw"、力口氏孚L桿菌(丄ac〖o(jì)6(3cz7/ws,以及它們的組合。13.如權(quán)利要求ll的食品產(chǎn)品,其特征在于所述雙歧桿菌屬菌種選自下列所構(gòu)成的組兩歧雙歧桿菌(BzyVdc^acfer〖wm6(/Vdw附)、長2又歧桿菌(5(/VJoZacer/ww/o"gww)、嬰兒雙歧桿菌(5z/zWo6a"eWMw/"/a"f&)、短雙歧桿菌(5z/V(io6acfer/"m6reve)、青春只又歧桿菌(5(/7do6aCe〃'wwado/e"ew〃"、乳酸雙歧豐干菌(5(/Vdo6a"eWwm/ac〃s),以及它們的組合。14.如權(quán)利要求ll的食品產(chǎn)品,其特征在于所述鏈球菌屬菌種選自下列所構(gòu)成的組嗜熱鏈球菌(iSYre/^ococcw51f/7er附o/3/n7Ms)、乳酸鏈球菌()S7re/^ococcw/ac""、乳月旨鏈球菌(^SVre/ococcwscremor/"、3又乙醜鏈球菌(iS/ye/^ococcwsd/ac"y/cW",以及它們的組合。15.如權(quán)利要求ll的食品產(chǎn)品,其特征在于所述酵母是選自于下列所構(gòu)成的群組乳酒假絲酵母(Ca"(iz.cfaKe^/^r)、弗羅梭、糖酵母(Sacc/2ar0myces/7orew〃"ws)、酉良酒酵母(5Wc/mrow戶scW"ae),以及它們的組合。16.如權(quán)利要求10的食品產(chǎn)品,其特征在于所述可食性材料選自下列所構(gòu)成的組液體乳制品、發(fā)酵乳、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、豆?jié){、發(fā)酵豆?jié){、蔬果汁、果汁、運(yùn)動飲料、甜點(diǎn)、果凍、糖果、嬰兒配方奶粉、保健食品、動物飼料以及膳食補(bǔ)充劑。17.如權(quán)利要求10的食品產(chǎn)品,其特征在于該食品產(chǎn)品被制成速溶沖泡食品的形式。全文摘要本發(fā)明揭示兩株具有抗炎活性以及有益的益生性質(zhì)的乳桿菌分離株,也就是沙克乳桿菌(Lactobacillussakei)GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-89,它們分別以保藏編號BCRC910355與BCRC910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC),以及以保藏編號CCTCCM207153與CCTCCM207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。這兩株乳桿菌分離株及其繼代培養(yǎng)后代可被用于制備各式的食品產(chǎn)品,以及用于制備用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的藥物組合物。文檔編號A61P29/00GK101575582SQ20081009139公開日2009年11月11日申請日期2008年5月8日優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日發(fā)明者俞篤文,呂英震,李浚笙,謝豐欽,陳靚珮,黃璻尹申請人:景岳生物科技股份有限公司
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