專利名稱：：治療用合成寡核苷酸的制作方法治療用合成寡核苷酸本申請是申請日為2000年12月12日，國際申請?zhí)朠CT/CA00/01467,國家申請?zhí)枮?0818858.0，發(fā)明名稱為"治療用合成寡核苷酸"的申請的分案申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療癌癥的寡核苷酸組合物。
背景技術(shù)：
：癌癥是一種非正常細(xì)胞的異常凈積聚，它主要由過度增殖、不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡或二者結(jié)合所致。增殖是通過細(xì)胞周期致使一個(gè)細(xì)胞分裂為兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞連續(xù)積聚。細(xì)胞周期的5個(gè)主要階段是G。、G,、S、G2和M。在G。階段，細(xì)胞是靜止的。在任何時(shí)候，體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞處于該階段。G,階段期間，對應(yīng)于分裂信號的細(xì)胞產(chǎn)生DNA合成所需的RNA和蛋白質(zhì)。S-階段期間(SE:早期S-階段；SM:中期S-階段；和SL:后期S-階段)，細(xì)胞復(fù)制其DNA。G2階段期間，構(gòu)建蛋白質(zhì)，為細(xì)胞分裂作制備。有絲分裂(M)階段期間，細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期過程中的變化發(fā)生于所有癌癥中，這種變化可由基因的過度表達(dá)、調(diào)節(jié)基因的突變或DNA損傷關(guān)卡的消失引起(HochhauserD.,Anti-CancerChemotherapeuticAgents8:903，1997)。與癌細(xì)胞不同，大多數(shù)正常細(xì)胞不會因?yàn)樽兓诘募?xì)胞衰亡而無限度地增殖。細(xì)胞衰亡是一種導(dǎo)致細(xì)胞生長停止的程序化細(xì)胞死亡反應(yīng)(Dimri等，Proc.Natl.Aca.d.Sci.USA92:20，1995)。據(jù)報(bào)道，DNA損傷，結(jié)腸、乳腺和卵巢癌細(xì)胞與拓?fù)洚悩?gòu)體抑制劑的接觸以及鼻咽癌細(xì)胞與順鉑的接觸可通過誘導(dǎo)衰亡來防止這些細(xì)胞的增殖(Wang等，CancerRes.58:5019，1998;Poele等，Br.J.Cancer80:9，1999)。合成寡核苷酸是在細(xì)胞中內(nèi)在化的多陰離子序列(Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta1197:95，1994)。據(jù)報(bào)道，合成寡核苷酸選擇性地與核酸(Wagner，R.Nature:372:333，1994)、特異性細(xì)胞蛋白質(zhì)(Bates等，J.Biol.Chem.274:26369，1999)和特異性核蛋白質(zhì)結(jié)合(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252:207，1998)來抑制癌細(xì)胞的增殖。據(jù)報(bào)道，合成的含鳥嘌呤(G)和可變數(shù)量的胸腺嘧啶(T)的27個(gè)堿基的序列(寡核苷酸GTn)，其中n1或7并且其中堿基的數(shù)量20(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252:207，1998)通過序列與45kDa核蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合抑制癌細(xì)胞系的生長；但另據(jù)報(bào)道，其中堿基數(shù)量20的GTn對癌細(xì)胞系沒有活性(Morassutti等，NucleosidesandNucleotides18:1711，1999)。據(jù)報(bào)道，兩種合成的用3'-氨基垸基修飾的15個(gè)堿基和29個(gè)堿基的富含GT的寡核苷酸形成G-四集體，該四集體與核仁蛋白結(jié)合并抑制癌細(xì)胞系的增殖(Bates等，J.Biol.Chem.274:26369，1999)。據(jù)報(bào)道，合成的6堿基TTAGGG-硫代磷酸酯在體內(nèi)和體外抑制非洲淋巴瘤細(xì)胞的增殖，所述硫代磷酸酯具有與哺乳動物端粒重復(fù)序列相同的序列(Mata等，Toxicol.AppliedPharmacol.144:189，,1997)。但另據(jù)報(bào)道，合成的6堿基TTAGGG-磷酸二酯不具有抗端粒酶的活性(US5,643,890)。細(xì)胞死亡可由促進(jìn)細(xì)胞凋亡的免疫調(diào)節(jié)劑，或者由直接引發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞死亡途徑的凋亡誘導(dǎo)劑引起(Muzio等，Cell85:817，1996;Levine，A.，Cell88:323，1997)。細(xì)胞凋亡是一種主動的細(xì)胞死亡過程，其特征在于顯著的形態(tài)學(xué)變化，這些變化包括核染質(zhì)的縮聚、細(xì)胞皺縮、核破碎、原生質(zhì)膜形成氣泡并形成膜結(jié)合的細(xì)胞凋亡體(Wyllie等，Int.Rev.Cytol.68:251，1980)。細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)志是細(xì)胞核DNA分解為寡核小體長度的碎片，這是內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶活化的結(jié)果(WyllieA.，Nature284:555，1980)。半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶(Caspases)作為一種關(guān)鍵酶參與細(xì)胞凋亡的后期過程。半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶家族包括至少14種有關(guān)的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶。所有的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶都包含保守的QACXG(其中X是R、Q或G)五肽活性位點(diǎn)基元(CohenG.，Biochim.Bi叩hys.Acta1366:139,1997)。許多半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶是作為無活性酶原被合成的，所述酶原在半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的特異性分解位點(diǎn)分解后被活化(CohenG.，Biochim.Biophys.Acta1366:139，1997);或者它們作為無活性的酶被合成，這些酶需與用于活化的調(diào)節(jié)分子結(jié)合(Stennicke等，J.Biol.Chem.274:8359，1999)。除了它們在細(xì)胞凋亡中的作用以外，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶還與B和T淋巴細(xì)胞的活化和增殖、炎癥期間細(xì)胞因子的成熟、紅細(xì)胞生成期間祖代細(xì)胞的分化和晶狀體纖維的發(fā)育有關(guān)(Fadeel等，Leukemia14:1514，2000)。關(guān)于B和T淋巴細(xì)胞，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3在B淋巴細(xì)胞以及CD4(+)、CD8(+)、CD45RA(+)和CD45R0(+)亞型的T淋巴細(xì)胞的活化中起作用(Alam等，J.Exp.Med.190:1879，1999)。此外，促細(xì)胞分裂劑和白介素-2對T淋巴細(xì)胞的刺激與半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶途徑的活化和PARP的分解有關(guān)(Wilheim等，Eur.J.Immunol.28:891，1998)。關(guān)于細(xì)胞因子，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3活性是通過活化的T淋巴細(xì)胞釋放IL-2(Posmantur等，Exp.CellRes.244:302，1998)和促炎細(xì)胞因子白介素-16的加工和成熟所必需的(Zhang等，J.Biol.Chem.273:1144，1998)。關(guān)于紅細(xì)胞生成，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的活化與紅細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)有關(guān)，據(jù)示該酶調(diào)節(jié)GATA-1，一種對于紅細(xì)胞前體的成熟至關(guān)重要的核調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(DeMaria等，Nature401:489，1999)。細(xì)胞溶解是細(xì)胞的完全或部分破壞，它由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)。活化的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生包括，但不限于細(xì)胞因子的生物活性分子。細(xì)胞因子包括，但不限于白介素(IL)-1、IL-1|3、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-ot。IL-lp降低骨髓細(xì)胞對細(xì)胞減^性藥物、放射和自體骨髓移植中使用藥物的體外腫瘤細(xì)胞清除的敏感性(Dalmau等，BoneMarrowTransplant.12:551，1993)。IL-6誘導(dǎo)B細(xì)胞分化，刺激IgG分泌(Taga等，J.Exp.Med.166:967，1987)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化(Lee等，Vaccine17:490，1999)并促進(jìn)巨核細(xì)胞成熟(Ishibashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8953，1989)，并且對癌細(xì)胞還具有抗增殖因子(Mori等，Biochem.Biophys.Res.Co畫.257:609，1999;Alexandroff等，Biochem.Soc.Trans.25:270，1997;Takizawa等，CancerRes.53:18，1993:Novick等，Cytokine4:6，1992)和增殖前因子(proproliferativefactor)的功能(Okamoto等，CancerRes.57:141,1997;Okamoto等，Int.J.Cancer72:149，1997;Chiu等，Clin.CancerRes.2:215,1996;Lu等，Clin.CancerRes.2:1417，1996)。在鼠的腫瘤模型中，工L-IO提高疫苗的效力(Kauffman'等，J.Iiranunother.22:489，1999)并上調(diào)抗癌自體反應(yīng)性T細(xì)胞的反應(yīng)(Alleva等，I腿unobiol.192:155,1995)。IL-12單獨(dú)和與其它細(xì)胞因子聯(lián)合使用時(shí)，促進(jìn)白細(xì)胞的成熟并誘導(dǎo)Y-干擾素的分泌。據(jù)報(bào)道，IL-12具有抗癌活性(Stine等，AnnalsNYAcademyofScience795:420，1996;Chen等，JournalofImmunol.159:351，1997),所述活性包括，但不限于活化特異性溶細(xì)胞性T淋巴細(xì)胞，活化天然殺傷細(xì)胞(NK)并誘導(dǎo)抗血管生成蛋白質(zhì)IP-10和MiG。TNF-a引起實(shí)體腫瘤的壞死(Porter等，TrendsinBiotech.9:158，1991)，敏化癌細(xì)胞對y放射引發(fā)的細(xì)胞凋亡(Ki咖ra等，CancerRes.59:1606，1999)并保護(hù)骨髓前體細(xì)胞，使其免受抗腫瘤劑的影響(Dalmau等，BoneMarrowTransplant.12:551，1993)。然而，大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)的抗癌療法，無論是涉及誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還是激發(fā)免疫系統(tǒng)的，都被證明不能滿足臨床的應(yīng)用。這些療法中的許多方法不夠有效或具有毒性，具有明顯的副作用，導(dǎo)致形成耐藥性或免疫致敏，以及致患者虛弱。因此，一直需要新的組合物和方法，所述組合物和方法能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯、抑制癌細(xì)胞增殖、活化癌細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶、誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡并刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過提供包含2—20個(gè)鄉(xiāng)基的3'-0H，5'-OH合成寡核苷酸(下文稱"序列")的組合物和方法滿足了這種需要，所述寡核苷酸選自(G工)n、(T,Gx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GJy)b、(TyGx)b、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是l一7的整數(shù)，n是l一12的整數(shù)，a和b是一個(gè)或多個(gè)As、Cs、Gs或Ts，并且其中所述序列誘導(dǎo)一種選自下列的反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、活化癌細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶、誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。將治療動物癌癥的有效量的包含序列和可藥用載體的組合物施用于患癌癥的動物，包括人。本發(fā)明的序列在下列方面具有出人意料的和令人驚奇的能力滿足了醫(yī)療領(lǐng)域長足的未實(shí)現(xiàn)的需求并對動物，包括人具有重要的益處，所述方面是誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、活化癌癥細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶并誘導(dǎo)癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種有效治療動物，包括人的疾病的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種有效治療癌癥的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)細(xì)胞衰亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制細(xì)胞增殖的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制癌細(xì)胞增殖的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于Fas的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于TNFR1的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于p53/p21的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于p21/waf-1/CIP的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于P15^B的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于Pl6ink4的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)不依賴于TGF-pl受體的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)非激素依賴性癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)非耐藥性癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種活化細(xì)胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種活化癌細(xì)胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療自身免疫疾病的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療淋巴細(xì)胞增殖性疾病的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療感染的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療炎癥的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)節(jié)T-或B-細(xì)胞活化的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)節(jié)祖代細(xì)胞成熟的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種增強(qiáng)針對細(xì)胞的其它治療劑的效果的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種增強(qiáng)針對癌細(xì)胞的化療劑的效果的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種增強(qiáng)放射的抗腫瘤效果的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1J3的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種剌激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-12的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-oc的組合物和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種易于制備的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供對接受者毒性最低的組合物。在閱讀了下列公開的技術(shù)方案和附錄權(quán)利要求書的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得十分清晰。圖1:用0|ig/inl和100蹄/ml的6堿基GTSEQIDNO:25培養(yǎng)的Jurkat人T細(xì)胞白血病細(xì)胞的熒光[Fluo-3-AM]。圖2:不使用0嗎/ml和100pg/ml的GTSEQIDN0s:66、67、81、82的83培養(yǎng)的Jurkat人T細(xì)胞白血病細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3的活化(用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(A)和比色法(B)測定)。圖3:Jurkat人T細(xì)胞白血病細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的活化。(A)用0pg/ml和100pg/ml的6堿基GTSEQIDNO:25培養(yǎng)的細(xì)胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3的活化；(B)用0pg/ml和100嗎/ml的6堿基GTSEQIDNO:25培養(yǎng)的細(xì)胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶7的活化(a)和PARP含量(b)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種包含2—20個(gè)堿基的3'-OH，5'-OH合成寡核苷酸(序列)的組合物，所述寡核苷酸選自(G;Ty)n、(TyG丄、a(GxTy)n、a(TyG》n、(GxTy)b、(TyG丄b、a(GxTy)b、a(TyG》nb，其中x和y是l一7的整數(shù)，n是1一12的整數(shù)，a和b是一個(gè)或多個(gè)As、Cs、Gs或Ts，其中所述序列誘導(dǎo)選自下列的反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、活化癌細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。將治療動物癌癥的有效量的包含序列和可藥用載體的組合物施用于患癌癥的動物，包括人。本發(fā)明的序列在下列方面具有出人意料的和令人驚奇的能力滿足了醫(yī)療領(lǐng)域長足的未實(shí)現(xiàn)的需求并對動物，包括人具有重要的益處，所述方面是誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和活化癌癥細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。本發(fā)明采用的術(shù)語"序列"是指2—20個(gè)堿基的3'-OH，5'-OH合成寡核苷酸，其中包含A、C、G和T堿基。.本發(fā)明采用的縮寫"GT"、"AG"、"CG"、"GG"、"AGT"和"CGT"是指以任何順序合成的包含指定堿基的序列。本發(fā)明采用的術(shù)語"反應(yīng)"是指誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、活化癌癥細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。本發(fā)明采用的術(shù)語"治療性治療"和"有效量"是指有效誘導(dǎo)選自下列反應(yīng)的量誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、活化癌癥細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。本發(fā)明采用的術(shù)語"懸浮腫瘤模型"和"實(shí)體腫瘤模型"是指原發(fā)性或繼發(fā)性癌或肉瘤。本發(fā)明采用的術(shù)語"化療劑"是指一個(gè)國家或州政府的管理部門批準(zhǔn)的，或者美國藥典或其它通常知道的藥典列出的用于治療動物，包括人的癌癥的任何藥物。本發(fā)明采用的術(shù)語"抗腫瘤"是指防止癌細(xì)胞的發(fā)育、成熟、增殖或擴(kuò)散。本發(fā)明采用的術(shù)語"增強(qiáng)"是指大于各種藥物相加的活性的協(xié)同程度。本發(fā)明采用的術(shù)語"協(xié)同"是指兩種或多種藥物協(xié)調(diào)作用。給動物，包括人施用有效量的本發(fā)明序列是一種預(yù)防、治療或消除疾病的治療性治療，所述疾病包括，但不限于癌癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、淋巴細(xì)胞增殖性疾病和哮喘。癌癥包括，但不限于鱗狀細(xì)胞癌、纖維肉瘤、類肉瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、骨肉瘤、皮膚黑素瘤、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膀胱癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和由其生成的轉(zhuǎn)移瘤。序列的治療有效性可通過不限于下列的方法得到增強(qiáng)化學(xué)修飾堿基、糖或磷酸酯骨架，化學(xué)添加序列或者用包含適當(dāng)序列的細(xì)菌質(zhì)粒用生物技術(shù)擴(kuò)增序列，將序列與生物或化學(xué)載體配合，或者將序列與組織型或細(xì)胞型定向的配體或抗體偶聯(lián)。'通過使本發(fā)明的序列與可藥用載體均勻、緊密地結(jié)合來制備包含一種或多種序列和可藥用載體的組合物?？伤幱幂d體包括液體載體、固體載體或包括這兩者。液體載體是水性載體、非水性載體或是這兩者，并且包括，但不限于水性懸浮液、油性乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位置特異性乳液、長滯留乳液、粘性乳液、微乳和毫微乳。固體載體是生物載體、化學(xué)載體或是這兩者，并且包括，但不限于病毒載體系統(tǒng)、顆粒、微粒、毫微顆粒、微球、毫微球、微泵、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物和使序列緩釋的生物降解或非生物降解的天然的或合成的聚合物。用于配合序列與固體載體的方法包括，但不限于直接吸附于固體載體的表面;直接地或者通過連接部分與固體載體的表面共價(jià)偶聯(lián)；和與用于制備固體載體的聚合物共價(jià)偶聯(lián)。任選地，序列可通過添加非離子或離子性聚合物，例如聚氧化乙烯脫水山梨醇一油酸酯(土溫)或透明質(zhì)酸來穩(wěn)定。優(yōu)選的水性載體包括，但不限于水、鹽水和可藥用緩沖劑。優(yōu)選的非水性載體包括，但不限于礦物油和中性油或其混合物。與用于使所述序列呈示于響應(yīng)細(xì)胞的可藥用載體無關(guān)，可任選地包括賦形劑。這些賦形劑包括，但不限于抗氧劑、緩沖劑和制菌劑，還可以包括懸浮劑和增稠劑?？蓡为?dú)施用一種或多種序列，或者可將其與其它治療形式聯(lián)合施用，所述其它治療形式包括，但不限于化療劑、免疫治療劑、抗菌劑、抗病毒劑或與放療聯(lián)合施用?；焺┌ǎ幌抻诳勾x劑、DNA損害劑、微管破壞劑、微管穩(wěn)定劑、肌動蛋白解聚劑、生長抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、嘌呤抑制劑、嘧啶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、CDK抑制劑、血管生成抑制劑和分化促進(jìn)劑。給藥途徑包括，但不限于口服、局部、皮下、透皮、真皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、顱內(nèi)、損害部位內(nèi)、腫瘤內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、脊髓內(nèi)、前列腺內(nèi)、置入體腔、經(jīng)鼻吸入、肺吸入、經(jīng)皮、電介入途徑。根據(jù)給藥途徑，單位劑量體積優(yōu)選為約0.001—100ml/劑，更優(yōu)選為約0.01—50ml/劑，最優(yōu)選為約0.1—30ml/劑。每劑給予的序列的量優(yōu)選為約0.001—100mg/kg，更優(yōu)選為約0.01—10mg/kg和最優(yōu)選為約O.l—5mg/kg。本發(fā)明的序列或序列加治療劑可以以單劑療法、多劑療法或在一個(gè)治療方案中連續(xù)輸注的形式給藥一段時(shí)間，所述時(shí)間對于被治療的疾病、接受治療者的狀況和給藥途徑而言是適宜的。此外，所述序列可以在所述治療劑給藥之前、同時(shí)或之后給予。將有效增強(qiáng)化療劑的抗腫瘤作用量的序列與化療劑聯(lián)合施用于患癌癥的動物。每劑施用的治療劑的量優(yōu)選為約O.OOl—lOOOmg/m2或者約0.01—1000mg/kg，更優(yōu)選約0.01—500mg/W或者約0.01—500mg/kg并且更優(yōu)選約0.I—IOOmg/V或者約0.1—100mg/kg。施用的特定的序列和特定的治療劑、每劑的量、給藥方案和給藥途徑應(yīng)由醫(yī)師用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的方法決定，并且還應(yīng)取決于癌癥的類型、癌癥的嚴(yán)重程度、癌癥的位置和其它臨床因素，如接受者的大小、體重和身體狀況。此外，可任選地使用體外分折以幫助確定序列給藥或序列加治療劑給藥的最佳范圍。雖不期望受到下列假說的限制，據(jù)認(rèn)為本發(fā)明的序列形成一類新結(jié)構(gòu)，并且它們不是作為反義RNAs、反義DNAs、三倍螺旋體形成的DNAs、端粒酶抑制劑、轉(zhuǎn)錄活化劑或轉(zhuǎn)錄抑制劑而起作用。下列實(shí)施例將用于進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，而同時(shí)不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。相反，在閱讀本發(fā)明的說明書之后，對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說，應(yīng)該清楚必需借助各種其它的實(shí)施方案、其改變的和等同的方案，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神下來自我啟發(fā)。實(shí)施例1序列的制備磷酸二酯和硫代磷酸酯序列由HUKABELScientificLtd(Montreal,Quebec,Canada)用EXPEDITE8900自動DNA合成系統(tǒng)(PersS印tiveBiosystems,Inc.,Farminghan，MA)禾口由Sigraa-Genosys(Woodlands,TX)用算盤分割的合成技術(shù)(AbacusSegmentedSynthesisTechnology)制備。除非另有說明，使用的序列是磷酸二酯序列。除非另有說明，在臨用前，將序列分散到高壓滅菌的去離子水或高壓滅菌的藥用緩沖劑中，例如，但不限于鹽水。實(shí)施例2細(xì)胞和試劑所有的細(xì)胞系均得自AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Rockville,MD)并且在ATCC建議的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。表1顯示了細(xì)胞系、它們的產(chǎn)地和它們的特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>將細(xì)胞接種到6(1ml/孔)、24(0.5ml/孔)或96(0.1ml/孔)孔平底微滴板并保持在37'C下和596C02氣氛中。除非另有說明，將2.5X105個(gè)細(xì)胞/ml與0pg/ml(對照)和100pg/ml(治療的)的包含A、C、G和丁的2、一45個(gè)堿基的序列一起培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)施例3細(xì)胞增殖的測定用二甲基噻唑-二苯基四唑翁(MTT)還原測定細(xì)胞增殖(Mosman等，J.Immunol.Methods65:55，1983)。在570nm波長下用重疊的分光光度計(jì)閱讀器(ELX800，Bio-TEKInstrumentsInc.,Winooski，VT)測定MTTo實(shí)施例4Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的抑制Jurkat人白血病T細(xì)胞是耐受非典型的多種藥物ft人懸浮腫瘤細(xì)胞模型。將Jurkat細(xì)胞與27堿基的GT和CT序列一起培養(yǎng)(表2)。表2Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注表中'Tases"為"堿基如表2所示，JurkatT細(xì)胞的增殖被測試的GT序列抑制，但不被測試的CT序列抑制。將JurkatT細(xì)胞與3、6、9、12、14、15、18、21和24堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表4所示，6堿基GT序列抑制JurkatT細(xì)胞的增殖。GTSEQIDNO:25抑制60%增殖，AGTSEQIDNO:49抑制45%增殖。用PHARM/PCS-4軟件(MicrocomputerSpecialists,Philadelphia,PA)比較GTSEQIDNO:25和AGTSEQIDNO:49的相對效力，表明GTSEQIDNO:25是AGTSEQIDNO:49的效力的3.4倍。據(jù)報(bào)道，AGTSEQIDNO:49-硫代磷酸酯抑制端粒酶的活性并誘導(dǎo)非洲淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Mata等，Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189，1997)。為測定端粒酶活性，用PCR-端粒重復(fù)擴(kuò)增方法(TRAP)(Roche,Laval,Quebec,Canada)分析2x105個(gè)JurkatT細(xì)胞的提取物。在1—100g/ml濃度下，GTSEQIDNO:25-磷酸二酯表現(xiàn)出0—10%的抗端粒酶活性，而AGTSEQIDM):49-硫代磷酸酯表現(xiàn)出30—75%抗端粒酶活性。GTSEQIDNO:25-硫代磷酸酯和GTSEQIDNO:49-磷酸二酯都沒有表現(xiàn)出任何抗端粒酶活性。將JurkatT細(xì)胞與2、3、4、5、6和7堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表5)。表5Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>TTTGTT-TT(TG)'TT-31SEQIDNO:23-(6bases)GGTGGG隱GG(TG),GG48SEQIDNO:24-(6bases)GGGTGG-GG(GT),GG60SEOIDNO:25-(6bases)TTGTTT-TT(GT),TT34SEQIDNO:26-(6bases)TGGTTG-TG(GT)'TG42SEOIDNO:2W6bases)GGGGTGG-G3(GT)iG241SEOIDNO:62-(7bases)GGGTGGG-G2(GT)G328SEQIDNO:63-(7bases)TGGGTGG-TG2(GT)|G255SEOIDNO:64-(7bases)GGGTGGT-G2(GT),G2T48SEOIDNO:65-f7bases)注表中"bases"為"堿基"。如表5所示，2、3、4、5、6和7堿基的GT序列抑制JurkatT細(xì)胞的增殖。實(shí)施例5HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的抑制HL-60早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞是p53突變的人懸浮腫瘤模型。將HL-60細(xì)胞與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表6)。表6HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的y。抑制序列%抑制TGTGTG-(TG)37SEQIDNO:9-(6bases)GTGTGT-(GT)313SEQIDNO:10-(6bases)TTTGTT-TT(TG),TT13SEOIDNO:23-(6bases)GGTGGG-GG(TG),GG18SEQIDNO:24-(6bases)GGGTGG-GG(GT),GG35SEOIDNO:25-(6bases)TTGTTT-TT(GT),TT16SEOIDNO:26隱(6bases)注表中"bases"為"堿基"。如表6所示，6堿基的GT序列抑制HL-60細(xì)胞的增殖。實(shí)施例6MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制MCF-7人乳腺癌細(xì)胞是半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3陰性的、雌激素依賴性的人實(shí)體腫瘤模型。將MCF-7細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/ml)與3和6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表7)。表7MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表7所示，6和7堿基的GT序列抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。實(shí)施例7PC-3人前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制PC-3前列腺癌細(xì)胞是p53突變的、雄激素非依賴性的人實(shí)體腫瘤模型。將PC-3細(xì)胞(5x1()5個(gè)細(xì)胞/ml)與3和6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表8)。表8PC-3人前列腺癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表8所示，3和6堿基的GT序列抑制PC-3細(xì)胞的增殖。LNCaP人前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制LNCaP前列腺癌細(xì)胞是TGF-(31受體陰性的、雄激素-非依賴性的、轉(zhuǎn)移性人實(shí)體腫瘤模型。將LNCaP細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/ml)與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表9)。表9LNCaP人前列腺癌細(xì)胞增殖的％$"制序列%抑制TGTGTG"(TG)3SEOIDNO:9-(6bases)-9GTGTGT-(GT)3SEQIDNO:10-(6bases)4TTTGTT-TT(TG)TTSEQIDNO:2K6bases)14GGTGGG-GG(TG)GG犯OIDNO:24-f6bases)17GGGTGG-GG(GT)GGSEOIDNO:25-f6bases)18TTGTTT-TT(G"TTSEQIDNO:26-(6bases)22注表中"bases"為"堿基"。如表9所示，6堿基的GT序列抑制LNCaP細(xì)胞的增殖。實(shí)施例9THP-l人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞增殖的抑制THP-l急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞是無p53的人懸浮腫瘤模型。將THP-l細(xì)胞(1.6X106個(gè)細(xì)胞/ml)與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表10)。表10THP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞增殖的%抑制序列%抑制TGTGTG-(TG)30SEQIDNO:9扁(6bases)GTGTGT-(GT)311SEQIDNO:10-(6bases)TTTGTT-TT(TG)iTT8SEQIDNO:23-(6bases)GGTCGG-GG(TG)iGG6SEQIDNO:24-(6bases)GGGTGG-GG(GT),GG15SEOIDNO:25-f6bases)TTGTTT-TT(GT)iTT1SEOIDNO:26-(6bases)注表中"bases"為"堿基"。如表10所示，6堿基的GT序列抑制THP-1細(xì)胞的增殖。實(shí)施例100VCAR-3人卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制21OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞是p53突變的、p21/waf-1/Cip缺失的、轉(zhuǎn)移性人實(shí)體腫瘤模型。將OVCAR-3細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/ml)與2、6和18堿基的GT細(xì)胞一起培養(yǎng)并與6堿基的AGT序列一起培養(yǎng)(表11)。表11OVCAR-3人卵巢癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表11所示，2、6和18堿基的GT序列以及6堿基的AGT序列抑制0VCAR-3細(xì)胞的增殖。實(shí)施例11SK-OV-3人卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制SK-0V-3卵巢癌細(xì)胞是p53突變的、p21/waf-l/Cip缺失的、pl5inMB缺失的、pl6,缺失的、轉(zhuǎn)移性人實(shí)體腫瘤模型。將SK-0V-3細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/ml)與2、6和18堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表12)。表12SK-0V-3人卵巢癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表12所示，2、6和18堿基的GT序列抑制SK-0V-3細(xì)胞的增殖。實(shí)施例12磷酸二酯和硫代磷酸酯序列對細(xì)胞增殖的抑制據(jù)報(bào)道，通過用硫原子取代一個(gè)或多個(gè)磷酸酯基上的非橋氧原子修飾的天然磷酸二酯序列提高寡核苷酸序列在生物體液和細(xì)胞中對內(nèi)切核酸酶的穩(wěn)定性(Crooke等，AnticancerDrugs6:609,1991)。將Jurkat人白血病T細(xì)胞(表13)、LNCaP人前列腺癌細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/ral)(表14)和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞(5x1()5個(gè)細(xì)胞/ml)(表15)與具有氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)作為磷酸酯基的非橋接原子的6堿基的GT序列一起培養(yǎng)。表13Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表14LNCaP人前列腺癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表15MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注表中"oxygenatom"為"氧原子"；"sulfuratom"為"硫原子";注表中"bases"為"堿基"。*注"O"代表磷酸酯基中的氧原子，"S"代表硫原子<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表18所示，6、18、27和33堿基的GT序列以及15堿基的ACG序列不抑制EL-4鼠細(xì)胞的增殖。A20鼠白血病B細(xì)胞是一種懸浮腫瘤模型。將A20鼠白血病B細(xì)胞與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表19)。表19A20鼠B白血病細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表19所示，6堿基的GT序列抑制A20鼠B白血病細(xì)胞的增殖。實(shí)施例15犬癌細(xì)胞增殖的抑制D-17犬骨肉瘤細(xì)胞和CF-51犬乳腺癌細(xì)胞是實(shí)體腫瘤模型。將D-17犬骨肉瘤細(xì)胞(5xl05個(gè)細(xì)胞/ml)(表20)和CF-51犬乳腺癌細(xì)胞(5x10s個(gè)細(xì)胞/ml)(表21)與6、9、17、27和33堿基的GT序列并與15堿基的ACG序列一起培養(yǎng)。表20D-17犬骨肉瘤細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。表21CF-51犬乳腺癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如表22所示，人癌細(xì)胞比犬癌細(xì)胞和鼠癌細(xì)胞對6堿基的GTSEQIDNO:25產(chǎn)生的增殖抑制作用更敏感。兩種6堿基的GT序列對增殖抑制的協(xié)同作用將Jurkat人白血病T細(xì)胞與次最佳濃度(5.0g/ml)的6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表23)。表23Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>注.-表中"bases"為"堿基"。如表23所示，同時(shí)使用兩種6堿基的GT序列具有協(xié)同抑制JurkatT細(xì)胞增殖的作用。實(shí)施例18對化療劑抗腫瘤作用的增強(qiáng)在0、0.1、1.0或10.0pg/ml的5-氟尿嘧啶或順鉑的存在下，將Jurkat人白血病T細(xì)胞與1.0(ig/ml6堿基的GTSEQIDNO:25和27堿基的GTSEQIDNO:1—起培養(yǎng)(表24)。5-氟尿嘧啶是一種干擾DNA和RNA合成的抗代謝劑。順鉑是一種交聯(lián)DNA并抑制DNA前體的烷基化試劑。表24Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表24所示，6堿基的GTSEQIDNO:25和27堿基的GTSEQIDNO:1增強(qiáng)，并且GTSEQIDNO:25增強(qiáng)0.1禾n1.0jug/ml的順鉑對JurkatT細(xì)胞增殖的抗腫瘤作用。在0、0.1、1.0或10.0pg/ml的5-氟尿嘧啶或他莫昔芬的存在下，將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞(5x1()5個(gè)細(xì)胞/ral)與.0網(wǎng)/ml的6堿基的GTSEQIDNO:25和27堿基的GTSEQIDNO:1—起培養(yǎng)。他莫昔芬是一種雌激素拮抗劑。表25MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如表25所示，6堿基的SEQIDNO:25增強(qiáng)0.1pg/ml5-氟尿嘧啶和0.1pg/ml他莫昔芬對MCF-7細(xì)胞增殖的抗腫瘤作用。27堿基的SEQIDNO:1不增強(qiáng)5-氟尿嘧啶或他莫昔芬對MCF-7細(xì)胞增殖的抗腫瘤作用。實(shí)施例19重復(fù)的6堿基的GTSEQIDNO:25對增殖的抑制將Jurkat人白血病T細(xì)胞與1、2、3和4重復(fù)的6堿基的GG(GT)《G(SEQIDNO:25)—起培養(yǎng)(表26)。表26Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表26所示，6堿基的GTSEQ.IDNO:25對JurkatT細(xì)胞增殖的抑制率為60%,而12堿基的GTSEQIDNO:68、18堿基的GTSEQIDNO:69和24堿基的GTSEQIDNO:70對JurkatT細(xì)胞增殖的抑制作用減弱。6堿基的GTSEQ.IDNO:25的熔化溫度(Tm)為2.5°C，但GTSEQIDNO:68的熔融溫度升至56.8°C,GTSEQIDNO:69的熔融溫度為76.3°C，GTSEQIDNO:70的熔融溫度為86.3°C。實(shí)施例20由BacillusCalmette-guerin(BCG)衍生的序列對增殖的抑制據(jù)報(bào)道，BCG衍生的序列抑制體內(nèi)腫瘤的生長(Kataoka等，Jpn.J.CancerRes.83:244，1992)。另外據(jù)報(bào)道，當(dāng)與IMC細(xì)胞預(yù)先混合并注射到CDF-1小鼠中時(shí)，A-2(SEQIDNO:72)和BCGA-4(SEQIDNO:74)對IMC腫瘤生長的抑制分別達(dá)88%和37%。將Jurkat人白血病T細(xì)胞與由BCG衍生的45堿基的序列一起培養(yǎng)(表27)。表27Jurkat人白血病T細(xì)胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表27所示，BCG衍生的序列對JurkatT細(xì)胞增殖的抑制率S24%。實(shí)施例21細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)使用CYCLETESTPLUSDNA市售檢測盒(BectonDickinson)測定細(xì)胞周期階段。概括地說，如下得到細(xì)胞的核將細(xì)胞膜溶于非離子洗滌劑中，用胰蛋白酶除去細(xì)胞的細(xì)胞支架和核蛋白，用RNA酶消化細(xì)胞RNA并用精胺穩(wěn)定核染質(zhì)。將碘化丙錠加到細(xì)胞核中并在安裝有電子雙重識別能力的流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur，BectonDickinson,SanJose，CA)中分析它們的熒光。用M0DFITLT軟件(VeritySoftwareHouseInc.,Topsham,MA)分析在細(xì)胞周期的G。/G,、早期S(SE)、中期S(SM)、晚期S(SL)或G2/M階段積聚的細(xì)胞。將以指數(shù)生長的Jurkat人白血病T細(xì)胞(表28)和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/ml)(表29)與2、6、15、18、27和45堿基的包含A、C、G和T的序列一起培養(yǎng)。將細(xì)胞收集并離心，再測定細(xì)胞周期的階段。表28JurkatT人白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表28所示，在JurkatT細(xì)胞中，2、6和27堿基的GT序列誘導(dǎo)細(xì)胞周期的SE階段停止，6堿基的CG和AGT，18堿基的GT和45堿基的BCGA-l序列誘導(dǎo)細(xì)胞周期的SM階段停止，6堿基的AG序列誘導(dǎo)細(xì)胞周期的G。/G,階段停止。表29MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表29所示，在MCF-7細(xì)胞中，2和6堿基的GT序列誘導(dǎo)細(xì)胞周期的SE階段停止，6堿基的AGT序列和18堿基的GT序列誘導(dǎo)細(xì)胞周期的SM階段停止。實(shí)施例22GTSEQIDNO:25、ACSEQIDNO:79和GTSEQIDNO:25+ACSEQIDNO:79誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯將Jurkat人細(xì)胞白血病T細(xì)胞(1X1()6個(gè)細(xì)胞/ml)與6堿基的GTSEQIDNO:25—起培養(yǎng)24小時(shí)，其中補(bǔ)充有6堿基的ACSEQIDNO:79和6堿基的GTSEQIDNO:25+6堿基的ACSEQIDNO:79。GTSEQIDNO:25禾nACSEQIDNO:79通過混合所述寡核苷酸(l:1)并在65。C加熱10分鐘進(jìn)行雜交。作為對照，將GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79在65。C加熱10分鐘(表30)。表30Jnrkat人白血病T細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>如表30所示，6堿基的GTSEQIDNO:25誘導(dǎo)細(xì)胞周期的SE階段后期停止，而補(bǔ)充的6堿基的ACSEQIDNO:79對細(xì)胞周期沒有影響。GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79的雜交抵銷GTSEQIDNO:25對細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)作用。這些數(shù)據(jù)證明，為具有有效性，本發(fā)明的序列必須是單鏈的。實(shí)施例23細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)原生質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸的再分配和核基質(zhì)蛋白(NuMA)的釋放是正經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的特征(Martin等，J.Exp.Med.，182:1545,1995;Miller等，Biotechniques，15:1042，1993)。使用FITC-結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V(BDPharmingen，SanDiego，CA)通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡期間原生質(zhì)膜中磷脂酰絲氨酸的再分酉2。用市售的ELISA檢測盒(Oncogen/Calbiochem，Cambridge,MA)測定釋放到上清液中的NuMA。將Jurkat人白血病T細(xì)胞與50一的3、4、5、6禾B7GT堿基序列、5堿基的ACGT序列、6堿基的AG、GG、AGT和CGT序列以及7堿基的GG序列一起培養(yǎng)。表31顯示出凋亡的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(對磷脂酰-絲氨酸/膜聯(lián)蛋白V染色(PS/A-V)陽性的)和由細(xì)胞釋放的％衡貼。表31JurkatT細(xì)胞白血病細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表31所示，3、4、5和6堿基的GT、AG、CG和AGT序列誘導(dǎo)JurkatT細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。5堿基的ACGT和6堿基的CGT以及GG序列不誘導(dǎo)JurkatT細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例24細(xì)胞內(nèi)鈣的增高(Ca2據(jù)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)鈣(Ca"的增高與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)(Lam等，Mol.Endocrinol.7:686,1993)。用熒光探針Fluo-3-AM(CellPermaant，Molecular:Probes,Inc.,Eugene,OR)跟蹤(Ca2+)i。Fluo-3-AM熒光增強(qiáng)則表示(Ca2+)i增高。將Jurkat人白血病T細(xì)胞與6堿基的GTSEQ.N0:25—起培養(yǎng)24小時(shí)。離心收集細(xì)胞，將其懸浮于含1%FBS的PBS中，并在37'C用10一Fluo-3-AM負(fù)載1小時(shí)。在488nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長測定細(xì)胞熒光(FL1檢測器)。在FACSCALIBUR上用程序Cel顧ST(BectonDickinson)分析數(shù)據(jù)。如附圖1所示，JurkatT細(xì)胞與6堿基的GTSEQIDNO:25—起培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞熒光增強(qiáng)88%，表明(Ca"i增高了。實(shí)施例25細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體引發(fā)細(xì)胞凋亡，所述配體包括，但不限于Fas(CD95)和腫瘤壞死因子(TNF)。與FasLigand結(jié)合的Fas和與TNFRec印tor1結(jié)合的TNF引發(fā)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生導(dǎo)致半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶(caspases)活化的引號。半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶引發(fā)致命的與核DNA-碎裂有關(guān)的細(xì)胞凋亡完成的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)、核基質(zhì)蛋白(NuMA)的釋放并細(xì)胞底物接觸的喪失。將Jurkat人白血病T細(xì)胞(lx106/ml)與6和27GT堿基序列一起培養(yǎng)(表32)。如實(shí)施例23測定NuMA。表32Jurkat人白血病T細(xì)胞釋放的呢NuMA<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>269注表中"bases"為"堿基"。如表32所示，使用6堿基的GTSEQIDNO:25的％NuMA釋放大于使用27堿基的GTSEQIDN0s:1、2、3和4的％NuMA釋放。實(shí)施例266堿基的GTSEQIDNO:25和6堿基的ACSEQIDNO:79對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)將Jurkat人細(xì)胞白血病T細(xì)胞與6堿基的GTSEQIDNO:25—起培養(yǎng)24小時(shí)，其中補(bǔ)充有6堿基的ACSEQIDNO:79和6堿基的GTSEQIDNO:25+6堿基的ACSEQIDNO:79。GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79通過混合所述序列(1:1)并在65。C加熱10分鐘進(jìn)行雜交。作為X寸照，將GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79在65。C加熱10分鐘(表33)。如實(shí)施例23評價(jià)細(xì)胞凋亡。表33Jurkat人白血病T細(xì)胞的自田胞凋亡的誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表33所示，6堿基的GTSEQIDNO:25誘導(dǎo)JurkatT細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，但補(bǔ)充的6堿基的ACSEQIDNO:79對細(xì)胞凋亡沒有影響。GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79的雜交抵銷GTSEQIDNO:25的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。這些數(shù)據(jù)證明，為具有有效性，本發(fā)明的序列必須是單鏈的。實(shí)施例27草分支桿菌衍生的富含GT和富含AC的序列對增殖的抑制、細(xì)胞周期的停止和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用將Jurkat人白血病T細(xì)胞與草分支桿菌的murA基因(GenBank:AccessionN咖berX99776)衍生的富含GT和富含AC的序列一起培養(yǎng)。如實(shí)施例3通過還原MTT測定增殖的抑制作用，如實(shí)施例21通過流式細(xì)胞術(shù)用碘化丙錠測定細(xì)胞周期的停止，以及如實(shí)施例23，通過流式細(xì)胞術(shù)用膜聯(lián)蛋白-V-FITC評價(jià)細(xì)胞凋亡。表34Jurkat細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞周期的停止和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如表34所示，富含GT的SEQIDN0s:81、82和83抑制JurkatT細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)所述細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡；但富含AC的SEQIDNO:15對JurkatT細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡均沒有抑制作用。實(shí)施例28GT序列對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活化的調(diào)節(jié)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶識別3種主要的肽底物序列1)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-1、-4和-5)(SEQIDNO:84);2)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-2、一3和—7)(SEQIDNO:85);和3)lie—(Leu)-Glu—X—Asp(I(L)EXD;半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-8和-lO)(SEQIDNO:86)(Thornberry等，J.Biol.Chem.272:17907，1997)。蛋白質(zhì)革巴中序列的識別導(dǎo)致革巴的有限的和特異性的蛋白水解，正如在第一個(gè)實(shí)施例中，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3調(diào)節(jié)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7的活化；正如在第二個(gè)實(shí)施例中，分解的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)耙包括，但不限于核纖層蛋白；或者正如在第三個(gè)實(shí)施例中，活化的酶包括，但不限于PARP。使用5'_(:2酰胺間隔區(qū)臂與標(biāo)準(zhǔn)酰胺-羧基水溶性carbohexiimide綴合技術(shù)(Guy等，J.Chromatography.B.Biomed.Sci.Appl.706:149，1998)合成的寡核苷酸，通過化學(xué)保護(hù)的GT序列或化學(xué)保護(hù)的AC序列與化學(xué)保護(hù)的選自NH2-YVAD-C00H(SEQIDNO:84)、NH2-DEVD-COOH(SEQIDNO:85)和NH2-IEGD-COOH(SEQIDNO:87)的序列化學(xué)共軛生成NH2-XXXD-COO-GT序列構(gòu)成物。在共軛后，脫去反應(yīng)性羧酸酯和反應(yīng)性氨基的保護(hù)基。包括，但不限于NH廠YVAD-COO-GT;NH2-DEVD-COO-GT;禾卩麗2-I(L)EXD-COO-GT的肽-GT(本文稱PGT)序列構(gòu)成物被酶在D和GT之間的羧酸酯官能團(tuán)處裂解，所述酶包括，但不限于半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶、與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)的酶、膠原酶和金屬蛋白酶。這類裂解導(dǎo)致半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶獲得的GT序列從PGT中釋放。由此產(chǎn)生的胞內(nèi)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活性的增高可，例如提高化療劑對多種藥物耐藥的癌細(xì)胞的療效或者增強(qiáng)對弱抗原刺激的免疫反應(yīng)。為測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的活化，使用制造商建議的條件，將對照組和處理組細(xì)胞洗滌、固定、滲透化并與識別活化形式的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的FITC-綴合抗體(Pharmingen，SanDiego，CA)—起培養(yǎng)。在FACSCALIBUR上，使用程序CellQUEST(BectonDickinson),通過流式細(xì)胞術(shù)分析與活化的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3有關(guān)的熒光?；蛘?，采用基于與顏色指示分子硝基苯胺綴合的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶特異性的肽的分解分析，通過比色法測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的活化，該分析是在405以分光光度分析法定量進(jìn)行。實(shí)施例29GTSEQIDNOs:66、81、82和83以及AGC序列SEQIDNO:67對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的活化將JurkatT細(xì)胞白血病細(xì)胞與下列序列一起培養(yǎng)72小時(shí)33堿基的GTSEQIDNO:66;ll堿基的GTSEQIDNO:81(GTSEQIDNO:66的堿基1-11)、11堿基的GTSEQIDNO:82(GTSEQIDNO:66的堿基12-22)、11堿基的GTSEQIDNO:83(GTSEQIDNO:66的堿基23-33)和15堿基的ACGSEQIDNO:67。如實(shí)施例28，用FITC綴合抗體(Clone:C92-605)測定活性半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3(17-22kDa)。如附圖2A所示，33堿基的GTSEQIDNO:66和11堿基的GTSEQIDN0s:81、82和83各自誘導(dǎo)非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原3轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚园腚装彼衢T冬氨酰蛋白酶3，但15堿基的ACGSEQIDNO:67不誘導(dǎo)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原3轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚园腚装彼衢T冬氨酰蛋白酶3。也可如實(shí)施例28，經(jīng)比色法測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化。如附圖2B所示，在用33堿基的GTSEQIDNO:66和11堿基的GTSEQIDNOs:81、82和83處理的細(xì)胞中，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活性比對照細(xì)胞中高105%、77%、100%和60%，但在用15堿基的ACGSEQIDNO:67處理的細(xì)胞中，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化與對照細(xì)胞大致相同。實(shí)施例306堿基的GTSEQIDNO:25對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3活性的活化將JurkatT細(xì)胞白血病細(xì)胞與6堿基的GTSEQIDNO:25—起培養(yǎng)72小時(shí)。如實(shí)施例28，用比色法測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化。如附圖3A所示，用6堿基的GTSEQIDM):25處理的細(xì)胞中半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化比對照細(xì)胞中高323°/。。實(shí)施例31GTSEQIDNO:25對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-7的活化和PARP的分解將JurkatT細(xì)胞白血病細(xì)胞與6堿基的GTSEQIDNO:25—起培養(yǎng)72小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗滌三次，用lOraM服PES(pH7.5，含5mMMgCl2、1mM二硫蘇糖醇、1.5nM抑肽酶、10mM亮抑蛋白酶肽和2.5|im原釩酸鈉)溶解并測定溶解物的蛋白質(zhì)含量(BradfordJT.Anal.Biochem.72:248,訓(xùn))。通過蛋白質(zhì)印跡分析測定活化的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7和PARP的分解。將溶解物與Laemmli緩沖液(LaernmUU.Nature15:680，1970)混合，振搖并與10(TC加熱4分鐘。將Fiftyjig蛋白質(zhì)加到各泳道上，并在100V的恒定電壓下(1.5h),用10%(半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶)或17%(PARP)月桂基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)。將分得的蛋白質(zhì)在PVDF膜上進(jìn)行電印跡。用麗春紅染色該膜監(jiān)測相同的蛋白質(zhì)負(fù)載量。在4'C下用緩沖液將膜阻斷過夜，所述緩沖液含有1%Tris-緩沖的鹽水(2慮Tris-HCl，13.7mMNaCl，pH7.6和0.1%聚乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯(土溫20)(TBST)+5%脫脂奶粉。洗滌該膜并在室溫下與鼠單克隆IgG抗-半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7抗體(Pharmingen)(用TBST+1%BSA以1:1000稀釋的)或者與鼠單克隆IgG抗-PARP抗體(用TBST+1%BSA以1:1000稀釋的)(Pharmingen)—起培養(yǎng)1小時(shí)。用與辣根過氧化物酶(用TBST+59&脫脂奶粉以1:1000稀釋的)(Pharmingen)綴合的羊抗鼠IgG測定與半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7或PARP結(jié)合的IgG。用加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(ECL，Amersh柳,Corp.,Amersham,UK)展開印跡。如附圖3B所示，6堿基的GTSEQIDNO:25誘導(dǎo)非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原7(30kDa)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚园腚装彼衢T冬氨酰蛋白酶7(19-20kDa)以及活性PARP轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ畹钠?5kDa降解產(chǎn)物。實(shí)施例32半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活化的正反饋放大將Jurkat人白血病T細(xì)胞與下列序列一起培養(yǎng)72小時(shí)NH2-YVAD-CO-GG(GT)GG、NH2-DEVD-CO_GG(GT)GG、NH2-IEGD-COO-GG(GT)GG、NH廠YVAD-CO-AACCACAAGCCCAAC、NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC和NH2-IEGD-CO-AACCACAAGCCCAAC。測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7的活化。NH2-YVAD-CO-GT、NH2-DEVD-CO-GT和NH2-IEGD-COO-GT各自誘導(dǎo)非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3轉(zhuǎn)化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3以及非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7轉(zhuǎn)化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7，但NH2-YVAD-CO-ACG、NH2DVED-CO-ACG和NH2-IEGD-CO-ACG不誘導(dǎo)非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原3轉(zhuǎn)化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3或者非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7轉(zhuǎn)化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7。雖不期望受到下列假設(shè)的限制，但據(jù)認(rèn)為在含半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)，基礎(chǔ)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活性調(diào)節(jié)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的釋放，所述酶通過蛋白水解/水解NH2-XXXD-C00-GT構(gòu)成物活化GT序列。這通過釋放的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活化的GT序列導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活性(半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7的水平增高)的正放大。實(shí)施例33誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生除非另有說明，在37°(:和5%C02中，將1x106個(gè)細(xì)胞與100叫/ml的各種測試序列一起培養(yǎng)48小時(shí)。在100]nl培養(yǎng)上清液中，用合適的市售ELISA(BioSource，CamarilloCA)測定細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-12、IL-lp和TNF-a的產(chǎn)生(pg/ml)。IL-12ELISA測定IL-12p70絡(luò)合物和游離p40亞基。結(jié)果以與對照細(xì)胞相比，處理的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的增加"倍數(shù)"(x)表示。將THP-l人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞與2、3、6、9、12、14、15和18堿基的GT序列一起培養(yǎng)并測定細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生。(表35)。表35THP-l人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表35所示，2、3、6、9、12、14、15和18堿基的GT序列提高THP-l細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-6的量。將THP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞與6堿基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列一起培養(yǎng)并測定細(xì)胞因子IL-12和IL-16的產(chǎn)生(表36)。表36THP-l人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>如表36所示，6堿基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列提高THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-12和IL-6的量。表37概括了6堿基的序列對IL-12和IL-6合成的誘導(dǎo)。表376堿基序列誘導(dǎo)的IL-6和IL-12合成<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>據(jù)報(bào)道，BCG衍生的序列A-3(SEQIDNO:73)、A-4(SEQIDNO:74)、A-6(SEQIDNO:75)、A-7(SEQIDNO:76)、M3(SEQIDNO:77)和al(SEQIDNO:78)在體內(nèi)活化NK細(xì)胞(Kataoka等，Jpn.J.CancerRes.83:244，1992)。將THP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞與45堿基的BCG-衍生序列一起培養(yǎng)并測定細(xì)胞因子IL-12和IL-6的產(chǎn)生(表38)。表38TOP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。如表38所示，45堿基的BCG衍生的序列極輕微地提高THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12和IL-6的量。實(shí)施例34磷酸二酯和硫代磷酸酯序列誘導(dǎo)IL-12的產(chǎn)生將THP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)，所述序列具有作為磷酸酯基非橋接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并測定細(xì)胞因子IL-12的產(chǎn)生(表39)。表39THP-1急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>GGTGGG-GG(TG),GG(6堿基)SEQIDN0:24磷酸二酯，硫代磷酸酯3.7x-0.lxGGGTGG-GG(GT),GG(6堿基)SEQIDNO:25磷酸二酯，硫代磷酸酯2.Ox0.(kTTGTTT-TT(GT),TT(6堿基)SEQIDNO:26磷酸二酯，硫代磷酸酯3.8x0.lx如表39所示，用硫原子(硫代磷酸酯)替代磷酸酯基上的非橋接氧原子(磷酸二酯)明顯減少THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12的量。將THP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞與6堿基的GTSEQIDNO:25一起培養(yǎng)，所述序列具有作為磷酸酯基非橋接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并測定細(xì)胞因子IL-12的產(chǎn)生(表40)。表40THP-1人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12序列*1增加G0G0G。T0G0G。-G。G。(G0T。)iG。G。；(oxygenatom:base1to6)SEQDNO:25-(6bases)2.0G。G。G,T。G。G。-G。G。(G,T。),G。G。；(oxygenatom:base1,2,4,5,6;sulfiiratombase3)SEQIDNO:25-(6bases)(UG。G。G。T,G。G。-G。G。(G。T,),G。G。；(oxygenatom:base1,2,3,5,6;sulfiiratoirbase4)SEQIDNO:25.(6bases)0.2xG0G。G,T,G。G。-G。G。(G,T,)iG0G。；(oxygenatom:base1,2,5,6;sulfiiratom:base3,4)SEQIDNO:25"(6bases)0.5xG,G。G。T。GoG,-G,G。(G。T。),GoG,;(oxygenatom:base2,3,4>5;sulfuratom:base1,6)SEQIDNO:25-(6bases)-O.lxG。G,G。T0G,G。-G0G,(G0T0)iG,G0;(oxygenatom:position1,3'4，6;sulftiratom:position2,5)SEQIDNO:25-(6bases)-O.lxG,G,G。T。G,G,-G,G,(GoTo),G,G,;(oxygenatom:position3,4;sulfiiratom:position1,2,5,6)SEQIDNO:25-(6bases)0G,G,G,T,G,G,-G,G,(G,T,)iG,G,;(sulfiiratom:position1to6)SEQIDNO:25(6bases)0注表中"oxygenatom"為"氧原子"；"bases"為"堿基";"sulfuratom"為"硫原子"；"position"為"位置"。*注"O"代表磷酸酯基中的氧原子，"S"代表硫原子如表40所述，用硫原子(硫代磷酸酯)替代6堿基的GTSEQIDNO:25中的非橋接氧原子(磷酸二酯)明顯減少THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12的量。實(shí)施例35刺激人周圍血單核細(xì)胞中細(xì)胞因子的合成用Ficoll-Hypaque(AmershamPharmaciaBiotech,Baied'Urfee，Quebec,Canada),通過密度梯度離心全血，從7名健康的人分離周圍血單核細(xì)胞(下文稱"PBMCs")。將PBMCs與6堿基的GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培養(yǎng)并測定細(xì)胞因子IL-1卩、IL-6、IL-10和IL-12的產(chǎn)生。表41人PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>注表中"bases"為"堿基"。實(shí)施例36通過黑猩猩外周血液單核細(xì)胞合成細(xì)胞因子如實(shí)施例35所述從4只健康的黑猩猩中分離PBMCs。將PBMCs與6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培養(yǎng)，并測定細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-a的生成(表41)。表41通過黑猩猩PBMC生成細(xì)胞因牙<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>注表中"bases，，為"堿基"。如表41所示，6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了黑猩猩PBMC細(xì)胞生成細(xì)胞因子IL10和IL-12以及TNF-a。實(shí)施例37通過恒河猴外周血液單核細(xì)胞合成細(xì)胞因子如實(shí)施例35所述從4只健康的恒河猴中分離PBMCs。將PBMCs與6堿基GT、AGT'、CGT、AG、CG和GG序列一起培養(yǎng)，并測定細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-a的生成(表42)。表42通過恒河猴PBMC生成細(xì)胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如表42所示，6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了恒河猴PBMC細(xì)胞生成細(xì)胞因子ILIO、IL-12以及TNF-a。實(shí)施例386堿基GTSEQIDNO:25+5-氟尿嘧啶和6堿基GTSEQIDNO:25+他莫昔芬中的6堿基GTSEQIDNO:25對MCF-7人乳腺腫瘤的影響將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞作為異種皮移植物皮下植入到雌性裸BALB/c小鼠中。將小鼠分成6組，每組10只。在第0天，第l組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受6堿基GTSEQIDNO:25，第3組小鼠接受5-氟尿嘧啶，第4組小鼠接受他莫昔芬，第5組小鼠接受6堿基GTSEQIDNO:25+5-氟尿嘧啶，第6組小鼠接受6堿基GTSEQIDN0:25+他莫昔芬。治療4周后，將小鼠處死，并測定腫瘤質(zhì)量。第1組小鼠具有最大的腫瘤質(zhì)量，第2、3和4組小鼠的腫瘤質(zhì)量比第1組小鼠小，第5和6組小鼠的腫瘤質(zhì)量比第l、2、3和4組小鼠小。實(shí)施例393和6堿基GT序列和45堿基BCGA-3序列對LNCaP人前列腺癌腫瘤的影響將LNCaP人前列腺癌細(xì)胞作為異種皮移植物皮下植入到雄性裸nu/nu小鼠中。將小鼠分成5組，每組10只小鼠。在第0天，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受3堿基SEQIDN0:8，第3組小鼠接受6堿基GTSEQIDN0:25，第4組小鼠接受6堿基AGSEQIDN0:45,第5組小鼠接受45堿基BCGA-3SEQIDN0:69。治療4周后，將小鼠處死，并測定腫瘤質(zhì)量。第1組小鼠具有最大的腫瘤質(zhì)量，第5組小鼠的腫瘤質(zhì)量比第1組小鼠小，第2、3和4組小鼠的腫瘤質(zhì)量比第1和5組小鼠小。實(shí)施例413、6、8和27堿基序列對EL-4鼠T淋巴瘤的影響將EL-4鼠T淋巴細(xì)胞植入到C57/BL6小鼠體內(nèi)。將小鼠分成6組，每組10只小鼠。在第0天，第l組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受3堿基GTSEQIDN0:8，第3組小鼠接受6堿基SEQIDNO:25，第4組小鼠接受6堿基AGSEQIDNO:45，第5組小鼠接受18堿基GTSEQIDNO:18,第6組小鼠接受27堿基GTSEQIDN0:1。治療4周后，將小鼠處死，并測定腫瘤質(zhì)量。第l組小鼠具有最大的腫瘤質(zhì)量，第2、3、4、5禾n6組小鼠的腫瘤質(zhì)量比第1組小鼠小。實(shí)施例42將人結(jié)腸癌細(xì)胞系作為粘著細(xì)胞培養(yǎng)物維持。將處于指數(shù)生長期的細(xì)胞用2—20堿基GT、GA、GC或GG序列以O(shè)ug/ml—100"1/ml的劑暈處理24—72小時(shí)。通過MTT還原測定對細(xì)胞增殖的抑制，通過流動血細(xì)胞計(jì)數(shù)測定細(xì)胞周期停滯，通過膜聯(lián)蛋白-V結(jié)合或NuMA釋放測定細(xì)胞凋亡。在結(jié)腸癌細(xì)胞系中，GT、GA、GC或GG序列抑制增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用鹽水或者用在體外具有抗人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的抗癌活性的2—20堿基GT、GA、GC或GG序列治療皮下攜帶人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的SCID小鼠。用在體外具有抗人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的抗癌活性的2—20堿基GT、GA、GC或GG序列治療的小鼠的腫瘤質(zhì)量比用鹽水治療的小鼠顯著減小。雖然已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，并提供了其具體實(shí)施方案，但是顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不背離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下對其作各種改變和改進(jìn)。序列表<no>拜昂尼科生命科學(xué)有限公司<120>治療用合成寡核苷酸<130>OIUS0811888<150>60/170,325<151>1999-12-13<150>60/228,925<151>2000-08-29<160>87<170>Patentlnversion3.0<210>1<21>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>Igt卿gtgt卿g鵬gtgtgtg27<210>2<2U>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>2gggtgggtgggtgggtgggtgggtggg27<2103<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>3gggggtgggggtgggggtgggggtggg27<210>4<2>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>4g鵬gg魄ggggg魄ggggggtggg27<210>5<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>5tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt27<210>6<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>6tctctctctctctctctctctctctct27<210>7<211>3<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>7tgt3<210>8<211>3<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>8gtg3<210>9<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>9魄tg<210>10<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>10g鵬<210>11<211>9<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>11tgtg,<210>12<211>9<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>12魄鵬g<210>13<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>13tgtgtgtgtgtg<210>14<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>14gtgtgtgtgtgt<210>1512<211>14<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>15,gtgtg柳14<210>16<211>15<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>16g眺t卿gtgtg15<210>17<211>18<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>17t卿gtgtg卿gtg18<210>18<211>18<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>18gt卿卿gtgt卿18<210>19<211>21<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>19tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt2〗<210>20<211>21<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>20gt魄鵬gt卿gtgtg21<210>21<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>21t卿卿gt卿gtgtgtgtg24<210>22<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>22gt卿gtgtgt卿gtgt卿24<210>23<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>23tttgtt6<210>24<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>24ggtggg6<210>25<211>6<22>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>25gggtgg6<210>2654<211>6<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>26ttgttt<210>27<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>27<210>28<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>28ccgtcc<210>29<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>29tggttg<20>30<211>6<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>303tgtat<210>31<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>31鵬ga6<210>32<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>32gagtga6<210>33<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>33gggtct6<210>34<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>34c鵬g6<210>35<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>35鵬tcc6<210>36<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>36ctgtct6<210>3756<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>37tcgttc6<210>38<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>38cggtgc6<210>39<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>39ttgtgg6<210>40<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>40gggttt6<210>41<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>41ggttggG<210>42<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸57<400>42ggaagg<210>43<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>43ggccgg<210>44<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>44gggggg<210>45<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>45gggagg<20>46<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>46gggcgg<210>47<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>47ggaggg<210>48<21I>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>48gtgggg^<210>49<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>49ttaggg6<210>50<211>2<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>50gt2<210>51<211>2<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>51tg2<210>52<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>52魄g4<210>53<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸59<400>53ttgt<210>54<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>54卿<210>55<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>55ttgg<210>56<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>56g魄<210>57<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>57tgtt<210>58<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>58ggtt<210>5944444460<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>59tgtg4<210>60<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>60ggtgg5<210>61<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>61gggtg5<210>62<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>62ggg魄g:<210>63<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>63gggtggg:<210>64<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸61<柳>64tgggtgg<210>65<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>65gggtggt<210>66<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>66卿卿gtgtgt卿gt卿gtg<210>67<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>67gggtgggtgggtgggtgggtgggtggg<210>68<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>68gggggtgggggtgggggtgggggtggg<210>69<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>69gggggggtgggggggtgggggggtggg<210>70<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>70tgtgtg6<210>71<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>71gtgtgt6<210>72<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>72卿t6<210>73<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>73鵬ggG<210>74<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>74gggtgg6<210>75<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸63<400>75ttgttt6<210>76<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>76gccgagaaggtgcgcaacctgccggctggccacggactgaacgct45<210>77<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>77acgccgacgtcgtctgtggtggggtgtctaccgccaacgcgacgg45<210>78<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>78cgactacaacggctgggatatcaacaccccggcgttcgagtggta45<210>79<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>79ccaccc6<210>80<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>80cggta5<210>8164<211>11<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>81卿gtttggt11<210>82<211>U<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>82ggttttgtttg11<210>83<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>83ttgttttttttg12<210>84<211>4<212>PRT<213>合成肽<柳>84TyrValAiaAsp1<210>85<211>4<212>PRT<213>合成肽<柳>85AspGluValAsp1<210>86<211>5<212>PRT<213>合成肽65<220><221>SITE<222>(4)..(4)<223>X=任意氨基酸<400>86lieLeuGluXaaCys<210>.87<211>4<212>PRT<213>合成肽<400>87lieGluGlyAsp權(quán)利要求1.包含具有選自SEQIDNOs7-18、22-66、70-75、79和80-83序列的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸的組合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述序列選自SEQIDNOs:7、8、9、10、22-65、70-75、79和80。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述組合物還包含可藥用載體。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述組合物還包含化療劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述化療劑選自抗代謝劑、烷化劑和激素拮抗劑。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥選自原發(fā)性癌癥、繼發(fā)性癌癥、原發(fā)性肉瘤和繼發(fā)性肉瘤。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥選自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌和骨癌。全文摘要本發(fā)明提供一種包含2-20個(gè)堿基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)的組合物和方法，所述寡核苷酸選自(G_xT_y)_n、(T_yG_x)_n、a(G_xT_y)_n、a(T_yG_x)_n、(G_xT_y)_nb、(T_yG_x)_nb、a(G_xT_y)_nb、a(T_yG_x)_nb，其中x和y是1-7的整數(shù)，n是1-12的整數(shù)，a和b是一個(gè)或多個(gè)As、Cs、Gs或Ts，其中所述序列誘導(dǎo)選自下列的反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制增殖、活化癌細(xì)胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。文檔編號A61P35/00GK101491536SQ200810174018公開日2009年7月29日申請日期2000年12月12日優(yōu)先權(quán)日1999年12月13日發(fā)明者奈杰爾·C·菲利普斯,馬里翁·C·菲利翁申請人:拜昂尼科生命科學(xué)有限公司