本發(fā)明涉及基因治療領域，具體涉及一種基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體及其制備方法和應用。

背景技術：

1、基因治療是一種治療遺傳性疾病、癌癥及其它難治性疾病的有效手段，其中，腺相關病毒（aav）載體因其高效、穩(wěn)定的特點成為常用的基因治療工具。但aav載體在體內(nèi)應用時常引發(fā)免疫反應，導致治療效果受限，因此，通常需要對aav載體進行修飾處理，以減少免疫反應。現(xiàn)有的修飾技術存在諸多不足，如使用免疫抑制劑，往往存在副作用大，降低治療效果，得到的aav載體免疫原性仍然很高，免疫反應減少程度小，載體在宿主體內(nèi)的穩(wěn)定性和持續(xù)表達能力差等問題。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明提供一種基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體及其制備方法和應用。

2、本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，包括編碼治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因、修飾后的多聚核苷酸、低免疫原性的aav衣殼蛋白和至少一個免疫調(diào)節(jié)模塊；

3、所述轉(zhuǎn)基因被置于aav的反向末端重復序列之間，并連接至強啟動子和多聚腺苷酸化信號；

4、所述修飾包括但不限于5-甲基胞嘧啶修飾；

5、所述免疫調(diào)節(jié)模塊包括但不限于mirna或shrna序列，所述免疫調(diào)節(jié)模塊用于抑制體內(nèi)免疫應答的關鍵因子。

6、優(yōu)選的，還包括rna編輯技術，所述rna編輯技術用于選擇性修飾rna。

7、優(yōu)選的，所述rna編輯技術為crispr/cas13。

8、優(yōu)選的，所述低免疫原性的aav衣殼蛋白選自aav5、aav8或aav9的野生型或其經(jīng)過改造的變體。

9、優(yōu)選的，所述免疫調(diào)節(jié)模塊還包括免疫檢查點抑制劑的表達，免疫檢查點抑制劑為pd-1阻斷肽或pd-l1阻斷肽。

10、優(yōu)選的，低免疫原性aav基因治療載體還包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件為土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后元件（wpre）。

11、優(yōu)選的，低免疫原性aav基因治療載體還包括一個增強載體穩(wěn)定性的化學添加劑，所述化學添加劑為tween20或蔗糖。

12、本發(fā)明的目的之二在于提供一種低免疫原性aav基因治療載體的制備方法，包括以下步驟：

13、(a)克隆至表達載體：通過限制性內(nèi)切酶消化或無縫克隆技術將修飾后的多聚核苷酸、編碼治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因（含強啟動子和多聚腺苷酸化信號）、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件和aav衣殼蛋白克隆至表達載體中，限制性內(nèi)切酶為ecori和/或noti；

14、(b)病毒包裝：在hek293細胞系或其衍生物中使用lipofectamine進行轉(zhuǎn)染及病毒包裝，轉(zhuǎn)染比例為1:2（質(zhì)粒:轉(zhuǎn)染試劑），轉(zhuǎn)染時間24h；

15、(c)純化：通過密度梯度離心或/和親和層析純化得到所需的低免疫原性aav基因治療載體。

16、優(yōu)選的，所述(c)中的層析純化使用商業(yè)化試劑盒進行超濾純化，商業(yè)化試劑盒包括amicon?ultra-15超濾管，所述amicon?ultra-15超濾管的截留分子量為100?kda。

17、本發(fā)明目的之三在于提供一種低免疫原性aav基因治療載體在制備治療遺傳性疾病、癌癥或其它需要長期基因表達疾病的藥物中的應用。

18、本發(fā)明的有益效果為：

19、1、本發(fā)明通過多聚核苷酸修飾和免疫調(diào)節(jié)模塊，減少免疫反應，提高aav基因治療載體在宿主體內(nèi)的穩(wěn)定性和持續(xù)表達能力；其中，通過化學修飾（5-甲基胞嘧啶修飾），減少免疫刺激，提高rna的穩(wěn)定性和翻譯效率；通過引入mirna或shrna序列抑制體內(nèi)免疫應答的關鍵因子，并表達免疫檢查點抑制劑（pd-1/pd-l1阻斷肽），調(diào)節(jié)局部免疫環(huán)境，減少免疫反應，減少治療過程中因免疫反應導致的副作用，提高載體在宿主體內(nèi)的穩(wěn)定性和持續(xù)表達能力，從而在保證治療效果的同時提高安全性。

20、2、本發(fā)明通過選擇aav衣殼蛋白，具體的，通過選擇經(jīng)過驗證的aav5、aav8或aav9的野生型或其經(jīng)過改造的變體，提高組織靶向性和/或穿透血腦屏障的能力，提高載體在特定組織中的轉(zhuǎn)導效率，使得載體能夠更有效地到達目標組織，提高治療效果。

21、3、本發(fā)明通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，能夠增強mrna的穩(wěn)定性和翻譯效率，提高治療性蛋白的表達水平，如使用wpre轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，可以顯著增強mrna的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而提高轉(zhuǎn)基因的表達水平，增強治療性蛋白的表達水平，提高治療效果的一致性和持久性。

技術特征：

1.一種基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，包括編碼治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因、修飾后的多聚核苷酸、低免疫原性的aav衣殼蛋白和至少一個免疫調(diào)節(jié)模塊；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，還包括rna編輯技術，所述rna編輯技術用于選擇性修飾rna。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，所述低免疫原性的aav衣殼蛋白選自aav5、aav8或aav9的野生型或其經(jīng)過改造的變體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)模塊還包括免疫檢查點抑制劑的表達，免疫檢查點抑制劑為pd-1阻斷肽或pd-l1阻斷肽。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，還包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件為土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后元件。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，所述rna編輯技術為crispr/cas13技術。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體，其特征在于，還包括化學添加劑，所述化學添加劑為tween20或蔗糖。

8.一種如權(quán)利要求1-7任一項所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(c)中的層析純化使用商業(yè)化試劑盒進行超濾純化，商業(yè)化試劑盒包括amicon?ultra-15超濾管，所述amicon?ultra-15超濾管的截留分子量為100?kda。

10.一種如權(quán)利要求1-7所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治療載體在制備治療遺傳性疾病、癌癥或其它需要長期基因表達疾病的藥物中的應用。

技術總結(jié)
本發(fā)明涉及基因治療領域，具體涉及一種基于多聚核苷酸的低免疫原性AAV基因治療載體及其制備方法和應用，所述載體包括編碼治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因、修飾的多聚核苷酸、低免疫原性的AAV衣殼蛋白、免疫調(diào)節(jié)模塊；轉(zhuǎn)基因被置于AAV的反向末端重復序列之間；低免疫原性的AAV衣殼蛋白選自AAV5、AAV8或AAV9的野生型或其經(jīng)過改造的變體；免疫調(diào)節(jié)模塊包括miRNA或shRNA序列。本發(fā)明通過多聚核苷酸修飾和免疫調(diào)節(jié)模塊，減少免疫反應，提高AAV基因治療載體在宿主體內(nèi)的穩(wěn)定性和持續(xù)表達能力；通過選擇AAV衣殼蛋白，提高載體在特定組織中的轉(zhuǎn)導效率，使得載體能夠更有效地到達目標組織。

技術研發(fā)人員：董書萍,賀君
受保護的技術使用者：瑞吉明（山東）生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/5