00 yL LB液體培養(yǎng)基，37°C 100 r/min搖床溫育培養(yǎng)I h。培養(yǎng)后菌液5000 r/min離心2 min,棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 °C倒置培養(yǎng)過夜。
[0022]陽性克隆的選擇:
挑取6個克隆，轉(zhuǎn)接入裝有5 mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L)中，37°C培養(yǎng)12 h，利用質(zhì)粒提取試劑盒Min1-PlasmidRapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒。用以下反應(yīng)體系進(jìn)行酶切驗證:10 X Buffer H 2 μ L，DNA 5 μ L，Sac I 0.5 μ L, Kpn 10.5 μ L，ddH20 將體系補足20 yLo用fee I和治w I進(jìn)行雙酶切驗證，獲得陽性質(zhì)粒pCP-scrll。同時重組質(zhì)粒pCP-scrll送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序進(jìn)一步確定。
[0023]五、含基因的近平滑假絲酵母重組菌C parapsilosis pCP-^crll的構(gòu)建將帶有Kpn I同義突變位點的目的基因scrll插入大腸桿菌和近平滑假絲酵母表達(dá)載體pCP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCP-scrll，重組質(zhì)粒pCP-scrll轉(zhuǎn)化近平滑假絲酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過含有40 μ g/mL諾爾斯菌素的YPD平板篩選目的重組菌株C.parapsilosispCP-scrll ο
[0024]質(zhì)粒pCP-scrll的單酶切:
利用質(zhì)粒提取試劑盒Min1-Plasmid Rapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)從E.coli JM109中提取質(zhì)粒pCP-scrll。
[0025]按照水、緩沖液、基因或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內(nèi)離心10 s使液體集中于管底，37°C水浴I h，在管中加入1/10體積的1XQuickCut Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并過柱純化。將純化后的樣品用真空干燥機濃縮至5 ULo
[0026]反應(yīng)體系組成:10XQuickCutBuffer 5 μ L，DNA 20 μ L，QuickCut BcoR I1.5μ L，ddH20將體系補足50 μ L0
[0027]單酶切線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化近平滑假絲酵母:
在每管的80 μ L近平滑假絲酵母感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入5-10 ng單酶切線性化產(chǎn)物，輕輕混勻后轉(zhuǎn)入2 mm的電轉(zhuǎn)杯中，冰上靜置3 min。擦干水汽，置于電轉(zhuǎn)儀上，選擇酵母參數(shù)(電擊參數(shù):1500 V，200 Ω，25 μ F)，電轉(zhuǎn)化。電擊后立即加入I mL冰浴的I M的山梨醇，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，30°C，靜置培養(yǎng)2 h。然后將培養(yǎng)液于5，000 r/min離心5 min,棄上清400 ULo重懸細(xì)胞后，涂布于含有40 y g/mL諾爾斯菌素的YH)篩選平板，于30°C培養(yǎng)箱倒置2 do
[0028]陽性克隆的選擇:
將棄上清后，重懸的菌液吸取100 μ L涂布至含有40 μ g/mL的諾爾斯菌素抗性平板上。培養(yǎng)2天后，挑選菌落較大的克隆轉(zhuǎn)接入5 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30°C，220 r/min培養(yǎng)24h，取I mL菌液提取基因組。以重組C基因組為模板，使用引物SAT 1_1
和URA3t_2進(jìn)行PCR驗證，獲得陽性克隆C parapsi1sis pCP—scrlL.
[0029]六、重組菌株催化不對稱轉(zhuǎn)化制備(5)-苯基乙二醇利用近平滑假絲酵母重組菌催化不對稱還原反應(yīng):
將⑶-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中表達(dá)后，利用培養(yǎng)后的重組菌株Cparapsilosis pCP-^crll，以2-輕基苯乙酮為底物，催化不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng):在I mL 0.1mol/L pH 4.5~5.5的醋酸緩沖液中，或I mL 0.1 mol/L pH 6.0~7.0的磷酸緩沖液中，或ImL 0.1 mol/L pH 7.5-9.0的Tris-HCl緩沖液中，加入重組菌細(xì)胞濃度為0.1 g/mL，底物2-羥基苯乙酮濃度為6 g/L，反應(yīng)溫度20-40°C，反應(yīng)時間45 h。
[0030]近平滑假絲酵母iC.parapsilosis) CCTCC NO:M203011發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖 4%，酵母膏 0.5%，(NH4) 2ΗΡ04 1.3%，KH2PO4 0.7%，ZnSO4.7H20 0.03%，NaCl 0.01%，pH 7.0，以去離子水配制。
[0031]挑取陽性克隆單菌落接種于含有40 μ g/mL的諾爾斯菌素5 mL YPD的酵母生長培養(yǎng)基中，于28°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取I mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL近平滑假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。
[0032]培養(yǎng)后的重組近平滑假絲酵母細(xì)胞8，000 r/min離心10 min，并用生理鹽水洗滌三次后收集。在以下體系中進(jìn)行不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng):1 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH4.5-5.5)或 I mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0-7.0)，或 I mL 0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7.5~9.0)，加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，和0.1 g/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后在20-40°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)45 ho
[0033]反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心除去菌體，上清液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有機相用于分析。產(chǎn)物通過手性固定相高效液相色譜(Agillent HPl 100)進(jìn)行分析，條件為Chiralcel 0Β-Η 柱(4.6 mm X 25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流動相為正己烷/異丙醇(9/1，v/v)，流速0.4 mL/min，檢測波長為215 nm。產(chǎn)物的光學(xué)純度通過對映過量值來衡量。
[0034]產(chǎn)物(5)-苯基乙二醇對映過量值的計算:
對映過量值(e.e.%) = [ (Q-Q / (Q+Q) ] *100%,
產(chǎn)物(5)-苯基乙二醇產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％)= (Q/c0)noo%,
式中?為反應(yīng)后(5)-對映體的濃度，&為反應(yīng)后(對-對映體的濃度，G為反應(yīng)前底物2-羥基苯乙酮的濃度。
[0035]以全細(xì)胞為催化劑，不對稱生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，產(chǎn)物均為(5)-苯基乙二醇。
[0036](3)有益效果
成功構(gòu)建了大腸桿菌和近平滑假絲酵母的表達(dá)質(zhì)粒pCP-scrll，表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化近平滑假絲酵母感受態(tài)細(xì)胞，成功獲得重組型近平滑假絲酵母
C.parapsilosis pCP-^crlL.通過優(yōu)化反應(yīng)條件，在35°C，pH5.5的醋酸緩沖液中，利用0.1 g/mL重組近平滑假絲酵母細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化6 g/L底物2-羥基苯乙酮，產(chǎn)物(5)-苯基乙二醇的光學(xué)純度和產(chǎn)率達(dá)到99.9%和99.9%ο這些工作不僅為(5)-苯基乙二醇的高效制備提供了有效途徑，而且有助于認(rèn)識同一種酶在不同宿主中折疊方式對其立體選擇性的影響，對開發(fā)新型優(yōu)質(zhì)手性生物催化劑具有重要的意義。
[0037]生物材料樣品保藏:一株原位表達(dá)(5)-羰基還原酶II的近平滑假絲酵母重組菌，其分類命名為近平滑假絲酵母菌/(5)-羰基還原酶IU C parapsilosis pCP-^crll)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱:CCTCC，地址:中國武漢武漢大學(xué)；保藏編號:CCTCCNO:M2015107 ;保藏日期:2015年3月12日。
【附圖說明】
[0038]圖1是本發(fā)明的近平滑假絲酵母穿梭質(zhì)粒(pCP-scrll)構(gòu)建流程圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
實施例1
近平滑假絲酵母 ic.parapsilosis) CCTCC NO:M203011 (已在專利號:CN 03102140.2中公開)的菌體培養(yǎng)，其生長培養(yǎng)基YH)組成為:葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。將近平滑假絲酵母接種于5 mL試管中于28°C、200 r/min振蕩培養(yǎng)16-18 h。
[0040]實施例2
近平滑假絲酵母(C parapsilosis)基因組的提取:將實施例1培養(yǎng)的菌體于12，000r/min離心5 min，用生理鹽水洗滌兩次后，收集細(xì)胞利用基因組DNA提取試劑盒GenomicDNA Mini Preparat1n Kit (Takara 公司)提取基因組。
[0041]實施例3
從近平滑假絲酵母中提取目的基因SCTlI，將SCTlI中酶切位點Kpn I序列(GGTACC)同義突變?yōu)镚GCACA。
[0042]合成兩端引物
SCRII_5ac I_F1: 5? -ttcgggagct catgcaccac caccaccacc acggcgaaat cgaatcttatt-3’ {Sac I)，
SCRI\_Kpn I_R1:5’ -cggggtaccc tatggacaag tgtaaccacc a_3’ , {Kpn I)，
突變引物
}kvX_Kpn I_F2: 5’ -atgtcgggca caattgttaa tgt_3’，
Wut_Kpn I_R2: 5’ -acattaacaa ttgtgcccga cat-3’，
含有Kpn I同義突變位點的^crII基因的獲得:
PCR 反應(yīng)體系:ddH20 24.5 μ L，DNA 聚合酶 0.5 μ L，Mut_Kpn I_F2 引物 5 μ L，Mut_Kpn I_R2 引物 5 μ L, 5 X buffer 10 yLo
[0043]PCR 反應(yīng):98°C熱變性 10 s ；98°C 10 s，52°C 15 s，72°C I min。經(jīng)過 5-10 個循環(huán)后，取出PCR反應(yīng)液，加入引物SAT1_1和URA3t_2各I μ L，再進(jìn)行25個循環(huán)，最后72°C再延伸 10 min。利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purificat1n Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。
[0044]實施例4
表達(dá)載體PCP的構(gòu)建:
載體PCP構(gòu)建引物設(shè)計:
URA3p_l: 5’ -ccggaattcg tattgcaaac aaacg _3’ {EcoR I)，
URA3p_2: 5’ -cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca_3’ {Bgl II)，
MAL2p_l: 5， -gtcttcatac aagatctga