、枯草芽孢桿菌及天藍(lán)色鏈霉菌的基因組DNA作為模板。
[0065][2]根據(jù)惡臭假單胞菌的葡萄糖脫氫酶基因序列、枯草芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶基因序列、天藍(lán)色鏈霉菌的纈氨酸脫氫酶基因序列以及pET-duet質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)基因引物。
[0066]PPpglcdhF:5，-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’ (BamH I)
[0067]PPpglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’ (Hind III)
[0068]PBsadhF:5，-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3，(Kpn I)
[0069]PBsadhR:5，-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’ (Xho I)
[0070]PScvdhF:5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’ (Nde I)
[0071]PScvdhR:5，-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3，(Xho I)
[0072][3]利用惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌及天藍(lán)色鏈霉菌DNA作為模板做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR擴(kuò)增體系:模板2 μ L，上下游引物各0.5 μ L，dNTP Mix 4yL,1XEx TaqBuffer 5yL，滅菌 ddH20 37 μ L, ExTaq DNA 聚合酶 I μ L。PCR 反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，lmin, 56°C 退火，lmin, 72°C延伸，lmin 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C，1min,一個(gè)循環(huán)；15°C，10min，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。回收產(chǎn)物存放在1.5mL的離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0073][4]構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，導(dǎo)入感受態(tài)E.coliJM109o PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體pMD18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5yL，基因4.8yL, pMD18_IU 2 μ L，16°C過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑取菌落到1mL液體LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T_Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh,經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0074][5]將[4]中提取的質(zhì)粒pMD18-T_Ppglcdh和表達(dá)載體pET-duet分別用BamHI和Hind III進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-duet-Ppglcdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，用氨芐霉素抗性平板篩選陽性克隆。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保藏備用。
[0075][6]將[4]中提取的質(zhì)粒pMD18-T_Bsadh和表達(dá)載體pET-duet-Ppglcdh分別用Kpn I和Xho I進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將[4]中提取的質(zhì)粒pMD18-T-Scvdh和表達(dá)載體pET-duet-Ppglcdh分別用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/pET-duet-Ppglcdh+Scvdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，用氨芐霉素抗性平板篩選陽性克隆。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保藏備用。
[0076]實(shí)施例4:重組質(zhì)粒pET-28a-Ecltd/pET-28a_Seltd的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0077][I]以大腸桿菌、鼠傷寒沙門(氏)菌的基因組DNA作為模板。
[0078][2]根據(jù)大腸桿菌、鼠傷寒沙門(氏)菌的L-蘇氨酸脫氨酶基因序列以及pET_28a質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)ltd基因引物。
[0079]PEcltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3，(BamH I)
[0080]PEcltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3，(Hind III)
[0081]PSeltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3，(BamH I)
[0082]PSeltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3，(Hind III)
[0083][3]利用大腸桿菌及鼠傷寒沙門(氏)菌DNA作為模板做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR擴(kuò)增體系:模板 2 μ L，上下游引物各 0.5 μ L，dNTP Mix 4 μ L, 1XExTaq Buffer 5yL，滅菌ddH20 37 μ L, ExTaq DNA聚合酶I yL。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin 30s，30 個(gè)循環(huán);72°C，lOmin，一個(gè)循環(huán);15°C，lOmin，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在1.5mL的離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0084][4]構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18-T-Ecltd/pMD18-T_Seltd，導(dǎo)入感受態(tài) E.coli JM109。PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體pMD 18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5 μ L，基因4.8 μ L，pMD18-T 0.2 μ L，16°C過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑取菌落到1mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0085][5]將[4]中提取的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a分別用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保減備用。
[0086]實(shí)施例5:大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
[0087][I]大腸桿菌感受態(tài)的制備。將單克隆大腸桿菌于1ml LB培養(yǎng)基中活化，之后轉(zhuǎn)接于37°C振蕩培養(yǎng)至0D_0.35即可制備感受態(tài)；將培養(yǎng)好的菌液置于冰水中，輕輕搖晃使菌液迅速冷卻約1min ;準(zhǔn)備滅好菌的1.5ml離心管若干個(gè)，分裝菌液于管中，每管裝菌量1.2ml，將離心管放置于冰中；菌液離心8000r/min 10_20s，冰水中靜置2min，棄上清，加入預(yù)冷好的0.1M CaCl2400 μ L，輕輕吹吸懸浮液，放入冰中15min (該步驟重復(fù)2_3次)；最后，每管菌液離心棄上清后加入預(yù)冷好的0.1M CaCl280 μ L，輕輕吹吸懸浮菌液放入冰中。
[0088][2]質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。取[I]制備好的感受態(tài)細(xì)胞，加入需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，輕輕反復(fù)吹吸，并在冰中放置45min ;將離心管放入42°C水浴鍋準(zhǔn)確放置90s，然后取出迅速放入冰中5min ;加入LB培養(yǎng)基800 μ L，輕輕混合，37°C搖床培養(yǎng)1_1.5h ;菌體離心2min，棄大部分上清，再重新吹吸懸浮，取200 μ L于目標(biāo)抗性平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待轉(zhuǎn)化子長出之后提質(zhì)粒驗(yàn)證。
[0089]實(shí)施例6:串聯(lián)來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶及來源于蠟樣芽孢桿菌的L-亮氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)α -氨基丁酸和葡萄糖酸
[0090][I]將重組菌pET-28a-Ecltd/BL21和串聯(lián)有L-亮氨酸脫氫酶的pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21利用LB培養(yǎng)基活化，37 °C、160r/min培養(yǎng)過夜后分別轉(zhuǎn)接于2L的LB基中。接種量8%，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量l.0vvm。培養(yǎng)2-3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心1min收集菌體，用pH 7.0的50mM PB緩沖液分別將pET-28a_Ecltd/BL21和pET-28a_Bsglcdh+BcIdh/BL21兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的pH 7.0的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入IM L-蘇氨酸和IM葡萄糖及0.1% (v/v)tween-80,于30°C、300r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過程中補(bǔ)充碳酸I丐以保持反應(yīng)液pH為6.0。分不同時(shí)