在6.0-8.0之間，以HPLC檢測(cè)底物α -氨基丁酸及葡萄糖酸的產(chǎn)率。
[0035]本發(fā)明中，所用的葡萄糖脫氫酶選自:但不限于，芽孢桿菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶、假單胞菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶。所用的L-氨基酸脫氨酶選自:但不限于，芽孢桿菌來(lái)源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來(lái)源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來(lái)源的L-纈氨酸脫氫酶、紅球菌屬來(lái)源的L-苯丙氨酸脫氫酶。所述L-蘇氨酸脫氨酶選自:但不限于，大腸桿菌來(lái)源的L-蘇氨酸脫氨酶、鼠傷寒沙門(mén)(氏)菌來(lái)源的L-蘇氨酸脫氨酶。
[0036]本發(fā)明的有益效果:
[0037]α-氨基丁酸和葡萄糖酸是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，具有巨大的市場(chǎng)需求。本發(fā)明將葡萄糖脫氫酶與L-氨基酸脫氫酶串聯(lián)在質(zhì)粒上于Ε.coli BL21中的表達(dá)，構(gòu)建了共表達(dá)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶的工程菌株，同時(shí)結(jié)合構(gòu)建單表達(dá)L-蘇氨酸脫氫酶的重組Ε.coli BL21。利用這些重組菌對(duì)L-蘇氨酸及葡萄糖進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化為α -氨基丁酸和葡萄糖酸，轉(zhuǎn)化過(guò)程快速高效，且不需要添加任何輔因子，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明，以下實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明產(chǎn)生限制。
[0040]實(shí)施例1:重組質(zhì)粒pET-28a-Bcldh/pET-28a_Rjpdh的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0041][I]以蠟樣芽孢桿菌、紅球菌的基因組DNA作為模板。
[0042][2]根據(jù)枯草芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶及紅球菌的L-苯丙氨酸脫氫酶基因序列以及pET-28a質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)Idh基因引物。
[0043]PBcldhF:5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’ (BamH I)
[0044]PBcldhR:5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’ (Sac I)
[0045]PRjpdhF:5，-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3，(BamH I)
[0046]PRjpdhR:5，-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’ (Sac I)
[0047][3]利用蠟樣芽孢桿菌及紅球菌的DNA作為模板做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR擴(kuò)增體系:模板 2yL，上下游引物各 0.5yL，dNTP Mix 4 μ L, 1XExTaq Buffer 5yL，滅菌ddH20 37 μ L, ExTaq DNA 聚合酶 lyL。PCR 反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，Imin 30s，30 個(gè)循環(huán);72°C，lOmin，一個(gè)循環(huán);15°C，lOmin，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在1.5mL的離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0048][4]構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，導(dǎo)入感受態(tài) Ε.coliJM109。PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體PMD18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5 μ L，基因4.8 μ L，PMD18-T 0.2 nL, 16°C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到1mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0049][5]將[4]中提取的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a分別用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保減備用。
[0050]實(shí)施例2:重組質(zhì)粒 pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0051][I]以枯草芽孢桿菌基因組DNA作為模板。
[0052][2]根據(jù)枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因序列以及pET_28a質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)glcdh基因引物以及用于串聯(lián)L-氨基酸脫氫酶的glcdh基因引物。
[0053]PBsglcdhF:5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’ (BamH I)
[0054]PBsglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’ (Hind III)
[0055]P28aPromoterF:5，-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3，(Sph I)
[0056]PBsglcdhRBglI1:5，-GAAGATCTTTAACCGCGG CCTGCCTGG-3’ (Bgl II)
[0057][3]利用染色體DNA作為模板，做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR擴(kuò)增體系:模板2 μ L，上下游引物各 0.5 yL，dNTP Mix 4 μ L，10 X ExTaq Buffer 5“1^，滅菌(1(1!120 37 μ L，Ex TaqDNA聚合酶I yL。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，Imin 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C，10min，一個(gè)循環(huán)；15°C，10min，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在
1.5mL的離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0058][4]構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T_Bsglcdh，導(dǎo)入感受態(tài)E.coliJM109。PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體PMD18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5 μ L，基因4.8 μ L，pMD18_T0.2 μ L，16°C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37 V培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到1mL液體LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-Bsglcdh，經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于-70°C冰箱保藏。
[0059][5]將[4]中提取的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET_28a進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-glcdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保藏備用。
[0060][6]利用[5]提出的質(zhì)粒pET-28a-Bsglcdh作為模板，做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR擴(kuò)增體系:模板 2 μ L，上下游引物各 0.5 μ L，dNTP Mix 4 μ L, 1XExTaq Buffer 5yL，滅菌ddH20 37 μ L, ExTaq DNA聚合酶I yL。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，Imin，58 °C 退火，lmin 30s，72 °C 延伸，lmin 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C，1min，一個(gè)循環(huán)；15°C，lOmin，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。回收產(chǎn)物存放在1.5mL的離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0061][7]構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18_T-promoter+Bsglcdh，導(dǎo)入感受態(tài) E.coliJM109。PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體PMD18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5 μ L，基因4.8 μ L，PMD18-T 0.2 nL, 16°C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到1mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-pBSglcdh，經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0062][8]將[7]中提取的質(zhì)粒和實(shí)施例1中已經(jīng)連上L-氨基酸脫氫酶的表達(dá)載體pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh分別用Sph I及Bgl II進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[5]，用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，_40°C冰箱保藏備用。
[0063]實(shí)施例3:重組質(zhì)粒 pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/pET-duet-Ppglcdh+Scvdh 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0064][I]以惡臭假單胞菌