間取樣，離心并用0.22 μ m濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析。α -氨基丁酸的產(chǎn)率為102.Sg/L，葡萄糖酸的產(chǎn)率為196.8g/L。
[0091][2]氨基酸的HPLC分析條件:在EP管中依次加入轉(zhuǎn)化液樣品200 μ L，衍生劑400 μ L (取1mg鄰苯二甲醛+0.5ml無(wú)水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.1 M硼砂緩沖液及50 μ L 2-巰基乙醇)，混勻后等待2分鐘加入400 μ L 0.1M KH2PO4緩沖液，嚴(yán)格控制時(shí)間和試劑添加量，然后進(jìn)樣。色譜柱:dimosoil C18(5 μ I, 250mmX4.6mm)，流動(dòng)相:0.05M醋酸鈉緩沖液:甲醇-63:35，檢測(cè)器:UV Detector，檢測(cè)波長(zhǎng):338nm，柱溫:40°C，進(jìn)樣量:20yL,流速:1.0ml/mino
[0092][3]葡萄糖酸的HPLC分析條件:色譜柱:Aminex HPX-87 (300mmX 7.8mm)，流動(dòng)相:5mM H2SO4，檢測(cè)器:UV Detector，檢測(cè)波長(zhǎng):210nm，柱溫:30°C，進(jìn)樣量:10yL，流速:0.6ml/min。
[0093]實(shí)施例7:串聯(lián)枯草芽孢桿菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶及紅球菌來(lái)源的L-苯丙氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[0094]將重組菌pET-28a_Ecltd/BL21和串聯(lián)有L-苯丙氨酸脫氫酶的pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21利用LB培養(yǎng)基活化，37 °C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于2L的LB基中。接種量8%，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量l.0vvm。培養(yǎng)2-3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心1min收集菌體，用pH 7.0的50mM PB緩沖液分別將pET-28a_Ecltd/BL21和pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的pH7.0的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入IM L-蘇氨酸和IM葡萄糖及1% (v/v)甲苯，于30°C、300r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以IM NaOH溶液以保持反應(yīng)液pH為7.0。分不同時(shí)間取樣，離心并用0.22 μ m濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析(同實(shí)施例6中的HPLC方法)。測(cè)得α -氨基丁酸的產(chǎn)率為87.3g/L，葡萄糖酸的產(chǎn)率為164.2g/L。
[0095]實(shí)施例8:串聯(lián)惡臭假單胞菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶及枯草芽孢桿菌來(lái)源的L-丙氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[0096]將重組菌pET-28a_Seltd/BL21和串聯(lián)有L-丙氨酸脫氫酶的pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21利用LB培基活化，37°C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于2L的LB基中。接種量8 %，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量1.0vvm。培養(yǎng)2_3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心1min收集菌體，用pH 7.0的 50mM PB 緩沖液分別將 pET-28a-Ecltd/BL21 和 pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21 兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的PH 7.0的50mM PB緩沖液中，向該體系中投Λ IM L-蘇氨酸和IM葡萄糖及0.2% (v/v)曲拉通X100，于30°C、300r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以5M氨水以保持反應(yīng)液pH為8.0。分不同時(shí)間取樣，離心并用0.22 μ m濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析(同實(shí)施例6中的HPLC方法)。測(cè)得α -氨基丁酸的產(chǎn)率為67.6g/L，葡萄糖酸的產(chǎn)率為 135.2g/L。
[0097]實(shí)施例9:串聯(lián)惡臭假單胞菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶及天藍(lán)色鏈霉菌來(lái)源的L-纈氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[0098]將重組菌pET-28a_Seltd/BL21和串聯(lián)有L-纈氨酸脫氫酶的pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL21利用LB基活化，37°C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于2L的LB基中。接種量8%，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量1.0vvm。培養(yǎng)2_3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心1min收集菌體，用pH 7.0的50mM PB 緩沖液分別將 pET-28a-Ecltd/BL21 和 pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21 兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的pH 7.0的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入IM L-蘇氨酸和IM葡萄糖及0.5% &八)0^8，于30°(:、30(^/1^11進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以51氨水以保持反應(yīng)液pH為7.0。分不同時(shí)間取樣，離心并用0.22 μ m濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析(同實(shí)施例6中的HPLC方法)。測(cè)得α -氨基丁酸的產(chǎn)率為74.9g/L，葡萄糖酸的產(chǎn)率為142.2g/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α -氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征包括以下內(nèi)容: 1)將葡萄糖脫氫酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因構(gòu)建重組共表達(dá)載體pET-28a_Bsglcdh+Bcldh、 pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh 及 pET-duet-Ppglcdh+Bsadh、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh,并將其轉(zhuǎn)化E.coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a_Bsglcdh+Bcldh/BL21、pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21, pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL210同時(shí)將L_蘇氨酸脫氨酶(ltd)基因利用分子技術(shù)進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并將其轉(zhuǎn)化E.coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌 pET-28a-Ecltd/BL21 及 pET-28a_Ecltd/BL21。 2)使用重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。利用pH7.0的50mM PB緩沖液洗滌細(xì)胞然后將細(xì)胞重新懸浮于pH6.0-8.0的50mM PB緩沖液中，在不加入任何輔因子的情況下，加入1M L-蘇氨酸、1M葡萄糖及0.1-1%的增加細(xì)胞通透性的表面活性劑，利用添加一定的化學(xué)試劑調(diào)節(jié)使轉(zhuǎn)化的pH保持在6.0-8.0之間，并控制轉(zhuǎn)化的溫度在30-42°C之間，制備得到α -氨基丁酸和葡萄糖酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脫氫酶選自:但不限于，芽孢桿菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶、假單胞菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸脫氫酶選自:但不限于，芽孢桿菌來(lái)源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來(lái)源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來(lái)源的L-纈氨酸脫氫酶、紅球菌來(lái)源的L-苯丙氨酸脫氫酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的L-蘇氨酸脫氨酶選自:但不限于，大腸桿菌來(lái)源的L-蘇氨酸脫氨酶、鼠傷寒沙門(氏)菌來(lái)源的L-蘇氨酸脫氨酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α -氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的增加細(xì)胞通透性的表面活性劑為:但不限于，吐溫80、甲苯、曲拉通Χ100、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α -氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于不向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中添加任何輔因子。
【專利摘要】本發(fā)明是一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法。將葡萄糖脫氫酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因構(gòu)建重組共表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化至基因工程菌大腸桿菌內(nèi)。同時(shí)構(gòu)建好表達(dá)L-蘇氨酸脫氨酶的重組大腸桿菌。高效共表達(dá)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶于大腸桿菌中可以促進(jìn)輔因子在菌體胞內(nèi)的循環(huán)，不需要添加任何外源輔因子，利用該輔因子循環(huán)再生系統(tǒng)可以利用廉價(jià)底物L(fēng)-蘇氨酸及葡萄糖聯(lián)產(chǎn)高附加值的α-氨基丁酸和葡萄糖酸，該轉(zhuǎn)化過(guò)程簡(jiǎn)單快捷，成本低廉。在5L發(fā)酵罐中該方法所得的α-氨基丁酸和葡萄糖酸產(chǎn)量分別可達(dá)102.8g/L及196.8g/L，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種實(shí)際有效策略。
【IPC分類】C12P13/00, C12P7/58, C12N15/70
【公開號(hào)】CN105255934
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510814936
【發(fā)明人】饒志明, 周俊平, 楊套偉, 張蔡喆, 戚云龍, 鄭俊賢, 張顯, 徐美娟
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日