感病毒抗原中的一種或多種;進(jìn)一步優(yōu)選地，所述其他抗原為豬 傳染性胃腸炎病毒抗原。
[0082] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0083] 本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法;所述的生物材料，若無特 殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0084] 實(shí)施例1抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的制備、純化、鑒定及檢驗(yàn)
[0085] 1.1抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的制備和純化
[0086] 將豬流性腹瀉病毒HN1301株（參見中國專利CN104513827A)按照張麗燕等（張麗 燕.豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的研制.四川農(nóng)業(yè)大學(xué).碩士論文）中的方法純化病毒，免 疫小鼠，克隆獲得雜交瘤細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)制備2株單克隆抗體。
[0087] 將制備的2株單克隆抗體按照陳丹等（陳丹，孫廣瑞，柳增善.辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉 淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(26): 8105，8108)的辛酸-硫酸銨 聯(lián)合沉淀法純化單克隆抗體的操作方法分別純化抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體PEDV-McABl、抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體PEDV-McAB2。
[0088] 1.2抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的鑒定
[0089] 1.2.1單克隆抗體類型和亞類的鑒定
[0090] 運(yùn)用PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit并參照說明書對(duì)抗體的亞 型進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果見表1:
[0091] 表1各單克隆抗體類型的鑒定
[0094] 注:+表示陽性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)。
[0095] 由表1可知，單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2重鏈亞型都為IgG2a， 輕鏈類型都為kappa。
[0096] 1.2.2單克隆抗體特異性的鑒定
[0097] 將PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero細(xì)胞分別包被反應(yīng)板，測(cè)定單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2 與PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero細(xì)胞是否具有交 叉反應(yīng)性。
[0098] 測(cè)定結(jié)果顯示：單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2與TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero細(xì)胞均無交叉反應(yīng)，僅與PEDV反應(yīng)呈陽性，表明單克隆抗體PEDV-McABl、 單克隆抗體PEDV-McAB2均是抗豬流行性腹瀉病毒的特異性單克隆抗體。
[0099] 1.3純化后單克隆抗體的檢驗(yàn)
[0100] 1.3.1外觀檢驗(yàn)
[0101] 室溫下，肉眼觀察可見純化的單克隆抗體PEDV-McAB1、單克隆抗體PEDV-McAB2均 呈無色澄清狀態(tài)，未見絮狀物沉淀。
[0102] 1.3.2無菌檢驗(yàn)
[0103] 采用無菌檢驗(yàn)法，分別取純化后的單克隆抗體原料接種10ml/管的營養(yǎng)瓊脂斜面 培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基各2管(接種量為0.5ml/管）。接種后的硫乙醇 酸鹽培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基各一管置于30_35°C培養(yǎng)，另一管于2〇-25°C培養(yǎng)。改良 馬丁培養(yǎng)基置于20_25°C培養(yǎng)。同時(shí)以無菌生理鹽水同法操作做陰性對(duì)照。培養(yǎng)14天后均未 觀察到培養(yǎng)基中有微生物生長，觀察結(jié)果表明：單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2原料均符合無菌要求。
[0104] 1.3.3單克隆抗體的純度
[0105] 采用陳丹等（孫廣瑞，柳增善.辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng) 用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(26): 8105，8108)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行鑒定，上樣量為10yg， 檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明：單克隆抗體PEDV-McAB1、單克隆抗體PEDV-McAB2的純度均 不低于95%。
[0106] 1.3.4單克隆抗體相對(duì)親和力的測(cè)定
[0107] 將制備的單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2按照宋帥等（宋帥，林 彤，邵軍軍，?；菔|.抗〇型口蹄疫病毒單克隆抗體相對(duì)親和力的測(cè)定.獸醫(yī)免疫學(xué)，2009，25 (4) :333-335)中的操作方法測(cè)定其相對(duì)親和力。其中抗原的包被濃度為5yg/ml，酶標(biāo)二抗 的稀釋度為1:10000,測(cè)定純化后的單克隆抗體的相對(duì)親和力。計(jì)算結(jié)果表明：單克隆抗體 PEDV-McABl的相對(duì)親和力為0 · 78yg/ml，單克隆抗體PEDV-McAB2的相對(duì)親和力為0 · 44yg/ ml〇
[0108] 1.3.5單克隆抗體中和活性的測(cè)定
[0109] 2株單克隆抗體與500TCID5Q的不同來源的PEDV毒株中和后接種Vero細(xì)胞，通過中 和試驗(yàn)測(cè)定該單克隆抗體具有中和疫苗株P(guān)EDVCV777株、疫苗株SM98株及流行毒株的代表 毒株HN1301株的能力。測(cè)得單克隆抗體PEDV-McABl中和抗體效價(jià)均不小于1:512，表明單克 隆抗體PEDV-McABl具有良好的中和活性，而單克隆抗體PEDV-McAB2的中和抗體效價(jià)均小于 1:2，表明單克隆抗體PEDV-McAB2無中和活性。
[0110]表2用不同毒株與單克隆抗體中和后測(cè)得的中和抗體效價(jià)
[0111]
[0112] 1.4單克隆抗體含量的測(cè)定
[0113] 用BCA蛋白定量試劑盒分別對(duì)單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2按 照說明書進(jìn)行定量分析，測(cè)定結(jié)果表明：單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2的 濃度分別為4、4.5mg/ml。
[0114] 1.5單克隆抗體的配對(duì)
[0115] 選擇HN1301株豬流行性腹瀉病毒，稀釋到105Λ(Π05()/πι1，對(duì)不同搭配模式進(jìn)行檢 測(cè)，結(jié)果見表3:
[0116]表3單克隆抗體搭配
[0117]
[0118] 注："+"表示陽性，表示陰性。
[0119] 結(jié)果表明：標(biāo)記單克隆抗體PEDV-McABl和固定單克隆抗體PEDV-McAB2檢測(cè)豬流行 性腹瀉病毒液為陰性，其余搭配檢測(cè)結(jié)果均為陽性。因而選擇固定單克隆抗體PEDV-McABl、 標(biāo)記單克隆抗體PEDV-McAB2為搭配方式。
[0120] 實(shí)施例2單克隆抗體可變區(qū)序列的測(cè)定
[0121 ] 2.1單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)引物設(shè)計(jì)
[0122] 根據(jù)鼠源單克隆抗體的序列特征，設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)引物序列：
[0123]PI:5 '-ACTAGTTGACGTGGTCTCTAGGGTCACTTTAGTTTTCCT-3'
[0124]P2:5 '-CGGAAGCTTCCAGCGRCCARKCCATATACIGRTGG-3 '
[0125]設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)引物序列：
[0126]P3:5 '-GCCATCTCATGRAGWCATTKWCYCAAGTCTTT-3 '
[0127]P4:5 '-CGGACGCTTACTGCCTGGTAAGAAGATGGA-3 '
[0128] 2.2單克隆抗體可變區(qū)序列測(cè)定
[0129]按照張愛華等(張愛華，閉蘭，王志友等.系列鼠抗⑶分子單克隆抗體輕、重鏈可變 區(qū)基因的克隆和序列分析.中國生物制品學(xué)雜志，2001，15(2):65-68)建立的可變區(qū)序列測(cè) 定方法，通過分子克隆技術(shù)分別獲得單克隆抗體PEDV-McABl、單克隆抗體PEDV-McAB2的可 變區(qū)序列，選取對(duì)應(yīng)的克隆質(zhì)粒送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0130] 測(cè)定單克隆抗體PEDV-McABl的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的基因序列分別如SEQID No.l、SEQIDNo.3所示，由其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為SEQIDNo.2、SEQIDNo.4;單克隆 抗體PEDV-McAB2的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的基因序列分別如SEQIDNo.5、SEQIDNo.7 所示，由其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為SEQIDNo.6、SEQIDNo.8。
[0131]實(shí)施例3試劑盒的制備及應(yīng)用
[0132] 3.1試劑盒之膠體金檢測(cè)試紙條
[0133]膠體金檢測(cè)試紙條的制備:按照李紅梅等(李紅梅，聶政，陳佳等.免疫檢測(cè)用的膠 體金制備工藝的優(yōu)化研究.食品工業(yè)科技，2009，30(12): 289-291)建立的膠體金制備方法， 制備膠體金溶液并標(biāo)記單克隆抗體PEDV-McAB2，單克隆抗體PEDV-McABl和羊抗鼠IgG(購自 Sigma公司）噴涂在硝酸纖維素膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，將該硝酸纖維素膜和浸潤有 金標(biāo)單克隆抗體PEDV-McAB2的金標(biāo)墊用塑料外殼包裝起來，做成膠體金檢測(cè)試紙條。并配 置相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液作為樣品處理液。檢測(cè)時(shí)，將待檢樣品置于樣品處理管中，使樣品盡 可能溶解在溶液中，將含有待檢樣品的樣品處理管蓋子頭部折斷，滴加2-3滴混勻后的樣品 (約80μ1)至試紙條加樣孔中心；10分鐘后在檢測(cè)試紙條的檢測(cè)區(qū)觀察記錄結(jié)果，并依據(jù)判 定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)控線顯色則試驗(yàn)成立，檢測(cè)線顯色即為陽性、不顯色即 為陰性;質(zhì)控線未顯色則試驗(yàn)不成立，無論檢測(cè)線是否顯色均判定為無效結(jié)果，需重測(cè)。
[0134] 質(zhì)量研究：
[0135] (1)靈敏度檢驗(yàn):將PEDVΗΝ1301株病毒液(病毒滴度為106'5TCID5Q/ml)進(jìn)行10倍倍 比稀釋，稀釋至毒價(jià)為105'5TCID 5Q/ml、104'5TCID5Q/ml、103'5TCID5()/ml，用膠體金檢測(cè)試紙條 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示試紙條的檢測(cè)下限為l〇4、CID5()/ml。
[0136] (2)敏感性檢驗(yàn):將PEDV(HN1301株和CV777株)病毒液(病毒滴度均為106'5TCID50/ ml)進(jìn)行 10倍倍比稀釋，稀釋至毒價(jià)為 105'5TCID5Q/ml、104'5TCID5Q/ml、103'5TCID5Q/ml，用膠 體金檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示試紙條對(duì)PEDVHN1301株和CV777株的檢測(cè)下限均為 104-5TCID5〇/ml〇
[0137] (3)特異性測(cè)定:取豬傳染性胃腸炎病毒(華毒株)病毒液、豬輪狀病毒(0SU株)病 毒液、豬細(xì)小病毒(WH-1株)病毒液、豬痕病毒(C株)病毒液、豬偽狂犬病病毒(BarthaK-61 株)病毒液，以及陰性糞便樣品，按照膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示試紙 條檢測(cè)以上6份特異性樣品均為陰性。
[0138] (4)重復(fù)性試驗(yàn)
[0139]批間重復(fù)性:取3批豬流行性腹瀉病毒膠體金檢測(cè)試紙條按實(shí)施例3.1中所述的檢 測(cè)方法分別檢測(cè)PEDV陽性和陰性樣品。試紙條批間的符合率大于90%，且試紙條間檢測(cè)同 一份樣品的顯色強(qiáng)度一致。
[0140]批內(nèi)重復(fù)性:取1批豬流行性腹瀉病毒膠體金檢測(cè)試紙條，由1人對(duì)PEDV陽性和陰 性樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)三次。試紙條批內(nèi)的符合率大于90%，且試紙條間檢測(cè)同一份樣品的 顯色強(qiáng)度一致。
[0141]臨床應(yīng)用:將采集的20份臨床樣品按照實(shí)施例3.1中所述的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié) 果見表4。
[0142]同時(shí)，20份臨床樣品分別用鄒勇等建立的RT-PCR(鄒勇，錢永清，唐永蘭等.豬流行 性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒RT-PCR鑒別診斷技術(shù)研究.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，2: 82-84)和膠體金試紙條(韓國安捷公司，參照試劑盒參考說明書進(jìn)行操作)檢測(cè)，結(jié)果見表 4〇
[0143]由表4可知:試紙條的檢測(cè)結(jié)果和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)到了 90%，并且沒有 出現(xiàn)非特異性。安捷紙條與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率為80%，且有假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。故自 制膠體金試紙條的敏感性和特