異性均優(yōu)于安捷的膠體金試紙條。
[0144] 3.2試劑盒之酶免疫層析檢測(cè)試紙條
[0145]按照CN104062430A制備酶免疫層析檢測(cè)試紙條，如圖2所示，將實(shí)施例1制備的單 克隆抗體PEDV-McAB2進(jìn)行酶標(biāo)記，將實(shí)施例1制備的單克隆抗體PEDV-McABl和羊抗鼠IgG分 別噴涂在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，將該硝酸纖維素膜、酶標(biāo)墊和底物墊用塑 料外殼包裝起來，做成酶免疫檢測(cè)試紙條。并配制磷酸鹽緩沖液作為樣品處理液。
[0146]檢測(cè)時(shí)，將待檢樣品置于樣品處理管中，使樣品盡可能溶解在溶液中，將含有待檢 樣品的樣品處理管蓋子頭部折斷，滴加2-3滴混勻后的樣品（約80μ1)至試紙條加樣孔中心； 30分鐘后在檢測(cè)試紙條的檢測(cè)區(qū)觀察記錄結(jié)果，并依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)： 質(zhì)控線顯色則試驗(yàn)成立，檢測(cè)線顯色即為陽性、不顯色即為陰性;質(zhì)控線線未顯色則試驗(yàn)不 成立，無論檢測(cè)線是否顯色均判定為無效結(jié)果，需重測(cè)。
[0147]按照實(shí)施例3.1中毒株和倍比稀釋，進(jìn)行酶免疫層析檢測(cè)試紙條的質(zhì)量研究，進(jìn)行 靈敏度、敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明：（1)靈敏度檢驗(yàn)：顯示試紙條的檢測(cè)下限 為10 3'5TCID5〇/ml;(2)敏感性檢驗(yàn)：試紙條對(duì)TODVΗΝ1301株和CV777株的檢測(cè)下限均為 103'5TCID5Q/ml;(3)特異性測(cè)定:顯示試紙條檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒(華毒株)病毒液、豬 輪狀病毒(0SU株)病毒液、豬細(xì)小病毒(WH-1株)病毒液、豬痕病毒(C株)病毒液、豬偽狂犬病 病毒(BarthaK-61株)病毒液，以及陰性糞便樣品6份特異性樣品均為陰性；（4)重復(fù)性試 驗(yàn)：顯示試紙條批間和批內(nèi)的符合率均大于90%，且試紙條間檢測(cè)同一份樣品的顯色強(qiáng)度 一致。
[0148] 臨床應(yīng)用：將2~3滴(約80μ1)實(shí)施例3.1制備的20份臨床樣品滴加于酶聯(lián)免疫試 紙條的加樣孔處，同時(shí)迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在檢測(cè)試紙條的檢測(cè)區(qū)觀察記 錄結(jié)果，結(jié)果見表4。
[0149]由表4可知：酶免疫層析檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)到 了 100 %，并且沒有出現(xiàn)非特異性。
[0150] 表4膠體金檢測(cè)試紙條、酶免疫層析檢測(cè)試紙條、RT-PCR、安捷試紙條檢測(cè)臨床樣 品結(jié)果比對(duì)
[0151]
[0152] 注："+"表示檢測(cè)結(jié)果為陽性，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性
[0153] 3.3試劑盒之雙抗夾心5&11(^^(*41^15厶-1^厶81/2
[0154] 以雙抗夾心原理檢測(cè)臨床樣品中的PEDV，制備Sandwich-ELISA-McABl/2試劑盒： 取實(shí)施例1純化的單克隆抗體PEDV-McAB1用包被液(pH9.6的碳酸鹽緩沖液)稀釋至4μg/ml， lOOyL/孔，置于4°C包被過夜，取出用TOST洗板3次，拍干；用5%的脫脂奶粉以lOOyL/孔加 入，37°C封閉1小時(shí)，洗板3次，拍干；取滅活純化后的PEDVΗΝ1301株（滅活前含量為 lO^TCIDso/ml)作為陽性對(duì)照，用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，同時(shí)取待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，100μ L/孔，置于37°C作用lh，取出用TOST洗板3次，拍干;取HRP標(biāo)記的單克隆抗體PEDV-McAB2作 為二抗，做1000倍稀釋，1〇〇μL7孔，置于37°C作用lh，取出用PBST洗板3次，拍干;加入TMB(四 甲基聯(lián)苯胺)底物溶液50yL/孔，37°C反應(yīng)10min;最后加入50yL/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，用酶 標(biāo)儀檢測(cè)〇D45Q_結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以陽性對(duì)照的〇D45Qr?值和陰性對(duì)照的〇D45Qr?值作為標(biāo)準(zhǔn)，根 據(jù)樣品的(^伽^值來判斷樣品的陰陽性，即陽性對(duì)照0D45Qnm值-陰性對(duì)照0D45Qr"值>0.5則試 驗(yàn)成立，陽性對(duì)照〇D45Qr?值/陰性對(duì)照〇D45Qr?值2 2.1，待檢樣品0D45Qr?值2 〇 . 3時(shí)即為陽性， 否則為陰性。
[0155] 按照實(shí)施例3.1中毒株和倍比稀釋，進(jìn)行雙抗夾心Sandwich-ELISA-McABl/2的質(zhì) 量研究，進(jìn)行靈敏度、敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明：（1)靈敏度檢驗(yàn):顯示試劑盒 的檢測(cè)下限為l〇3'QTCID5Q/ml;⑵敏感性檢驗(yàn):試劑盒對(duì)PEDVHN1301株和CV777株的檢測(cè)下 限均為lO^TCIDso/mMS)特異性測(cè)定:顯示試劑盒檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒(華毒株)病毒 液、豬輪狀病毒(0SU株)病毒液、豬細(xì)小病毒(WH-1株)病毒液、豬痕病毒(C株)病毒液、豬偽 狂犬病病毒(BarthaK-61株)病毒液，以及陰性糞便樣品6份特異性樣品均為陰性；（4)重復(fù) 性試驗(yàn):顯示試劑盒批間批內(nèi)的變異系數(shù)均小于10%。
[0156] 臨床應(yīng)用:按照檢測(cè)方法對(duì)實(shí)施例3.1制備其中的10份臨床樣品進(jìn)行臨床檢測(cè)，其 結(jié)果見表5。
[0157] 表5RT-PCR和雙抗夾心Sandwich-ELISA-McABl/2檢測(cè)結(jié)果比較
[0159] 由表5可知：雙抗夾心Sandwich-ELISA-McABl/2的檢測(cè)結(jié)果和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完 全符合，靈敏度達(dá)到PCR量級(jí)，表明該2株單克隆抗體可以作為雙抗夾心ELI SA試劑盒的原材 料，用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗原。
[0160] 3.4試劑盒之競(jìng)爭(zhēng)(：〇1^6衍衍￥641^5厶-1^厶81/2/1+2
[0161] ELISA2的制備：取純化好的TODVHN1301株（107'5TCID5Q/ml)病毒抗原用包被液 (PH9.6的碳酸鹽緩沖液)稀釋1:10000后進(jìn)行包被，lOOyL/孔，同時(shí)做陰性對(duì)照（用roS緩沖 液代替）、陽性對(duì)照(滅活純化后的PEDVHN1301株，滅活前含量為104'QTCID5Q/ml)，4°C過夜， 取出用PBST洗板3次，拍干;用5%的脫脂奶粉以100μL7孔加入，37°C封閉1小時(shí)，洗板3次，拍 干;按照實(shí)施例1.1進(jìn)行繁殖和純化PEDVCV777株（lOMTCIDM/ml)，用稀釋液按照1:10V/V 的比例進(jìn)行梯度稀釋，并按l〇〇yL/孔添加，同時(shí)將每個(gè)待檢樣品按照1:10V/V的比例稀釋3 個(gè);將實(shí)施例1純化后的單克隆抗體用稀釋液稀釋至l〇〇yg/mL，按100μL孔添加，于37°C反 應(yīng)30分鐘，洗滌3次，拍干，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗用稀釋液按1:1X104V/V 進(jìn)行稀釋，然后l〇〇yL/孔加入，37°C反應(yīng)30分鐘，洗滌3次，拍干;加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底 物溶液50yL/孔加入，37°C反應(yīng)10分鐘;最后加入50yL/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè) 〇D450nm〇
[0162] 其中，當(dāng)單克隆抗體為單克隆抗體PEDV-McABl時(shí)作為Competitive-ELISA-McABl， 當(dāng)單克隆抗體為單克隆抗體PEDV_McAB2時(shí)作為Competitive-ELISA_McAB2，當(dāng)單克隆抗體 為單克隆抗體PEDV-McABl與單克隆抗體以1: 1V/V混合時(shí)作為Competitive-ELISA-McABl+ 2。然后，根據(jù)PEDVCV777株梯度稀釋經(jīng)Competitive-ELISA-McABUCompetitive-ELISA-McABSXompetitive-ELISA-McABl+S檢測(cè)后的OD45〇r? 值與梯度稀釋的濃度繪制競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲 線，并根據(jù)待檢樣品檢測(cè)的〇D45Qr?結(jié)果計(jì)算其所含的PEDV含量。
[0163] 按照實(shí)施例3. 1中毒株和倍比稀釋，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)Competitive-ELISA-McABl、 Competitive-ELISA-McAB2、Competitive-ELISA_McABl+2 試劑盒的質(zhì)量研究，進(jìn)行靈敏度、 敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明：（1)靈敏度檢驗(yàn)：顯示試劑盒的檢測(cè)下限均為 103Λ(：Ι05()/πι1;(2)敏感性檢驗(yàn)：3個(gè)試劑盒對(duì)PEDVHN1301株和CV777株的檢測(cè)下限均為 lO^TCIDso/mMS)特異性測(cè)定:顯示3個(gè)試劑盒檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒(華毒株)病毒液、 豬輪狀病毒(0SU株)病毒液、豬細(xì)小病毒(WH-1株)病毒液、豬痕病毒(C株)病毒液、豬偽狂犬 病病毒(BarthaK-61株)病毒液，以及陰性糞便樣品6份特異性樣品均為陰性；（4)重復(fù)性試 驗(yàn):顯示3個(gè)試劑盒批間批內(nèi)的變異系數(shù)均小于10%。
[0164]臨床研究:按照檢測(cè)方法將實(shí)施例3.1制備其中的10份臨床樣品進(jìn)行臨床檢測(cè)，計(jì) 算結(jié)果如表6所示：
[0165] 表6競(jìng)爭(zhēng)ELISA與RT-PCR檢測(cè)臨床樣本結(jié)果比對(duì)
[0166]
[0167] 結(jié)果顯示:Competitive-ELISA-McABl/2/1+2檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相吻合。
[0168]實(shí)施例4單克隆抗體鑒別聯(lián)苗
[0169]將哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的豬流性腹瀉、豬傳染性胃腸炎二聯(lián)活疫苗 用DMEM培養(yǎng)液按照疫苗使用說明書稀釋疫苗至lOUTCIDso/ml。
[0170] 取等體積稀釋后的疫苗分別與單克隆抗體PEDV-McABl(中和效價(jià)大于1: 512)、抗 PEDV高免血清（按照中國專利CN103705918A制備，中和效價(jià)大于1:512)置于37°C中和作用 lh。取中和后的病毒液先5倍稀釋，然后10倍倍比稀釋后，接種96孔板測(cè)定毒價(jià)。統(tǒng)計(jì)中和后 的細(xì)胞病變孔，計(jì)算毒價(jià)。結(jié)果見表7。
[0171] 表7二聯(lián)活疫苗經(jīng)PEDV抗體中和后TGEV毒價(jià)
[0172]
[0173]結(jié)果顯示:上述數(shù)據(jù)顯示，二聯(lián)活疫苗使用高免血清中和PEDV后，TGEV毒價(jià)損失較 多，而使用單克隆抗體PEDV-McABl中和PEDV后，測(cè)定TGEV毒價(jià)，更接近于配苗的理論值。因 此單克隆抗體PEDV-McABl可以用于二聯(lián)或多聯(lián)活疫苗中病毒含量的測(cè)定。
[0174]實(shí)施例5單克隆抗體PEDV-McABl預(yù)防和/或治療病毒感染的效果評(píng)價(jià)
[0175] 5.1單克隆抗體PEDV-McABl預(yù)防病毒感染效果評(píng)價(jià)
[0176] 篩選PEDV、PoRV、TGEV抗原、抗體雙陰性的2-3日齡仔豬15頭，隨機(jī)分為3組，第一組 和第二組分別口服實(shí)施例1中制備的單克隆抗體PEDV-McAB12mL，第三組口服PBS緩沖液 2mL，口服后24小時(shí)第一組和第三組口服PEDV流行毒株HN1301小腸毒2mL(含1000個(gè)最小發(fā) 病劑量），第二組口服CV777小腸毒(含1000個(gè)最小發(fā)病劑量），每日觀察仔豬的臨床癥狀，連 續(xù)觀察14天，通過臨床發(fā)病率、發(fā)病程度、死亡率及采用PCR方法檢測(cè)肛拭子中的病毒監(jiān)測(cè) 排毒天數(shù)來評(píng)價(jià)單克隆抗體PEDV-McABl的預(yù)防腹瀉病毒感染的效果，結(jié)果見表8。
[0177] 表8服用單克隆抗體PEDV-McAB1后預(yù)防PEDV感染的試驗(yàn)結(jié)果
[0180] 5.2單克隆抗體PEDV-McABl治療病毒感染效果評(píng)價(jià)
[0181] 篩選PEDV、PoRV、TGEV抗原、抗體雙陰性的2-3日齡仔豬20頭，隨機(jī)分為4組，第一組 和第二組分別口服PEDV流行毒株HN1301小腸毒2mL(含1000個(gè)最小發(fā)病劑量），第三組和第 四組口服CV777小腸毒(含1000個(gè)最小發(fā)病劑量），口服后12小時(shí)第一組和第三組分別口服 實(shí)施例1制備的單克隆抗體PEDV-McABl-2mL，第二組和第四組口服roS，每日觀察仔豬的臨 床癥狀，連續(xù)觀察14天，通過臨床發(fā)病率、發(fā)病程度、死亡率及采用PCR方法檢測(cè)肛拭子中的 病毒來監(jiān)測(cè)排毒天數(shù)，從而評(píng)價(jià)單克隆抗體PEDV-McABl治療豬流行性腹瀉病毒感染的效 果，結(jié)果見表9。
[0182] 表9PEDV感染后后12小時(shí)服用單克隆抗體PEDV-McABl治療的試驗(yàn)結(jié)果
[0183]
[0184] 結(jié)果表明，單克隆抗體PEDV-McABl能夠減輕由豬流行性腹瀉病毒引起的臨床癥 狀，減少死亡率以及減少排毒天數(shù)，有很好的預(yù)防和/或治療作用。
[0185] 實(shí)施例6基因工程抗體的制備
[0186] 按照李越等（李越.A型流感病毒單鏈抗體基因的克隆及抗病