本發(fā)明涉及組織工程關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)治療領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架的制備方法。

背景技術(shù)：

關(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床上是一種常見(jiàn)的疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，負(fù)重、運(yùn)動(dòng)則加重，限制了患處關(guān)節(jié)的活動(dòng),多發(fā)病于運(yùn)動(dòng)員、年老者,由于關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，缺乏血管、淋巴、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等，因此很難自我修復(fù),一旦發(fā)病，則往往發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎，重者需要人工關(guān)節(jié)置換。

這一疾病的治療以前有過(guò)多種治療手段，包括清創(chuàng)術(shù)、骨髓刺激術(shù)（如微骨折術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)等）、自體或異體軟骨膜和骨膜移植術(shù)、骨軟骨移植術(shù)、關(guān)節(jié)軟骨移植術(shù)等,但這些技術(shù)修復(fù)組織多以纖維軟骨為主、缺乏正常透明軟骨的力學(xué)性能及耐用性，同時(shí)也常常會(huì)出現(xiàn)一些并發(fā)癥如修復(fù)后過(guò)度生長(zhǎng)、骨膜增生、關(guān)節(jié)肥大、損壞正常組織、疾病傳染等。

隨著自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)（autologouschondrocyteimplantation,aci）的成熟，軟骨損傷修復(fù)治療逐漸進(jìn)入組織工程修復(fù)領(lǐng)域,第一代aci技術(shù)多采用自體骨膜瓣，易形成骨膜肥大，骨膜增生伸入關(guān)節(jié)腔往往需要二次手術(shù)切除,移植的骨膜也使軟骨下骨密度增加，導(dǎo)致新生軟骨組織退化，移植的骨膜生成的透明軟骨樣組織的生物力學(xué)性能、耐磨持久性不佳，易蛻變，整個(gè)手術(shù)過(guò)程操作復(fù)雜，費(fèi)用高昂。

第二代細(xì)胞療法采用一種可吸收的支架替代自體骨膜，減少了對(duì)健康組織的損害,但其仍需兩次手術(shù)，仍需縫合，技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，細(xì)胞分布不均衡，存在細(xì)胞流失的風(fēng)險(xiǎn)。

第三代的細(xì)胞療法則對(duì)以上技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，將自體軟骨細(xì)胞移植入一種可吸收的膜支架，并繼續(xù)培養(yǎng)一些天，可使細(xì)胞均勻分布于膠原膜中,然后將這一細(xì)胞膠原膜植入軟骨損傷處進(jìn)行修復(fù)，被稱(chēng)為基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)（matrix-inducedautologouschondrocyteimplantation(maci)）,這一技術(shù)術(shù)后恢復(fù)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小、修復(fù)面積達(dá)，可達(dá)20cm²，術(shù)后產(chǎn)生更多的透明軟骨,治療效果較為理想,這也避免了之前技術(shù)所引起的并發(fā)癥。然而maci技術(shù)仍然需要采集患者自體軟骨細(xì)胞，損壞正常軟骨組織，仍需二次手術(shù)，增加了患者痛苦，同時(shí)治療費(fèi)用昂貴。

另一方面，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞技術(shù)日益成熟，其在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用也越來(lái)越被關(guān)注。由于干細(xì)胞具有組織全能性，能分化成各種組織細(xì)胞，尤其是可分化成軟骨細(xì)胞，這使其在臨床上應(yīng)用于修復(fù)軟骨損傷成為可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)精確度差、靈敏度不足的缺陷，提供一種基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架的制備方法來(lái)解決上述問(wèn)題。

本發(fā)明公開(kāi)了一種基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架的制備方法，具體步驟為：

（1）、在無(wú)菌條件下，使用20ml的注射器，將1ml肝素鈉生理鹽水抽吸入注射器內(nèi)，然后繼續(xù)使用注射器抽入骨髓9ml，去掉針頭后，將肝素鈉生理鹽水和骨髓加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混合均勻后，得到骨髓懸液；

（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；

（3）、將患者的外周血分裝于50ml離心管中，每管45ml,在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，將上清離心30min，去沉淀，經(jīng)0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（4）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，在2000rpm的條件下，離心20min，然后吸取中間白膜層，然后向白膜層內(nèi)加入50mlpbs，并吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；

（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取15ml含自體血清和硫酸慶大霉素的dmem高糖培養(yǎng)基加入到目的細(xì)胞內(nèi)，然后將細(xì)胞吹打均勻，并計(jì)數(shù)，以5×10⁵/cm²接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基,該dmem高糖培養(yǎng)基也含10%自體血清和40u/ml硫酸慶大霉素；

（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；

（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置在顯微鏡下，觀察到細(xì)胞回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞從瓶壁上脫落，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10⁸/l，將細(xì)胞接種于75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；

（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3-4周后，細(xì)胞傳代3次；

（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（12）、將細(xì)胞懸液離心7min，棄上清，再用pbs洗滌細(xì)胞3次；

（13）、細(xì)胞計(jì)數(shù)，向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml；

（14）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，取一個(gè)無(wú)菌豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，糙面朝上，光面朝下放置于無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿中，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜；

（15）、將步驟（13）制備得到的細(xì)胞懸液滴入準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜上，細(xì)胞數(shù)約1×10⁶/cm²，繼續(xù)培養(yǎng)3天，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有40u/ml的硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（8）和步驟（12）中，離心轉(zhuǎn)速為1200rpm。

所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、移植當(dāng)天，用生理鹽水對(duì)步驟（15）得到的基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架沖洗3次，根據(jù)軟骨損傷處的形狀修剪豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，然后使糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，以修復(fù)軟骨損傷，本發(fā)明采用了一種豬腹膜源的ⅰ/ⅲ型膠原雙分子層膜結(jié)構(gòu)，其一面具有相對(duì)較高密度的膠原纖維，表面摩擦較低，細(xì)胞不通透，可阻止細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔擴(kuò)散，另一面為粗糙的表面，上面空隙較大，有利于軟骨細(xì)胞附著其中，這種膜具有持久性、耐撕裂，其可承受切割、打孔、縫合等操作，其具有彈性，可修成不同形狀，不會(huì)隨著時(shí)間的推移而收縮。其具有可吸收性，移植2周后可被降解吸收，可作為極佳的組織工程支架材料；

2、采用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow–derivedmesenchymal

stemcells，bmsc)作為種子細(xì)胞，其來(lái)源充足，通過(guò)簡(jiǎn)單的骨髓穿刺就可取材，不存在組織配型及免疫排斥反應(yīng)，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴(kuò)增，可克服體內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞來(lái)源有限、體外擴(kuò)增易導(dǎo)致種子細(xì)胞老化及生物學(xué)功能衰退的缺點(diǎn),同時(shí)也減少了患者手術(shù)次數(shù)，降低治療費(fèi)用；

3、使用自體血清，避免了使用胎牛血清可能引起的免疫原性反應(yīng)及疾病感染；

4、本技術(shù)采用硫酸慶大霉素作為抑菌劑，其濃度為40u/ml，對(duì)多種革蘭陰性菌及陽(yáng)性菌都具有抑菌和殺菌作用，可替代目前使用的青霉素和鏈霉素；

5、本發(fā)明可用于治療3-20cm²的軟骨損傷面積，修復(fù)面大,精確度高，靈敏度好。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

本發(fā)明公開(kāi)了一種基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架的制備方法，具體步驟為：

（1）、在無(wú)菌條件下，使用20ml的注射器，將1ml肝素鈉生理鹽水抽吸入注射器內(nèi)，然后繼續(xù)使用注射器抽入骨髓9ml，去掉針頭后，將肝素鈉生理鹽水和骨髓加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混合均勻后，得到骨髓懸液；

（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；

（3）、將患者的外周血分裝于50ml離心管中，每管45ml,在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，將上清離心30min，去沉淀，經(jīng)0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（4）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，在2000rpm的條件下，離心20min，然后吸取中間白膜層，然后向白膜層內(nèi)加入50mlpbs，并吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；

（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取15ml含自體血清和硫酸慶大霉素的dmem高糖培養(yǎng)基加入到目的細(xì)胞內(nèi)，然后將細(xì)胞吹打均勻，并計(jì)數(shù)，以5×10⁵/cm²接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基也含10%自體血清和40u/ml硫酸慶大霉素；

（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；

（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置在顯微鏡下，觀察到細(xì)胞回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞從瓶壁上脫落，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10⁸/l，將細(xì)胞接種于75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；

（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3-4周后，細(xì)胞傳代3次；

（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（12）、將細(xì)胞懸液離心7min，棄上清，再用pbs洗滌細(xì)胞3次；

（13）、細(xì)胞計(jì)數(shù)，向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml；

（14）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，取一個(gè)無(wú)菌豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，糙面朝上，光面朝下放置于無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿中，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜；

（15）、將步驟（13）制備得到的細(xì)胞懸液滴入準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜上，細(xì)胞數(shù)約1×10⁶/cm²，繼續(xù)培養(yǎng)3天，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有40u/ml的硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（8）和步驟（12）中，離心轉(zhuǎn)速為1200rpm，這樣可以防止細(xì)胞被損壞。

所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1

本發(fā)明公開(kāi)了一種基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架的制備方法，具體步驟為：

（1）、在無(wú)菌條件下，使用20ml的注射器，將1ml肝素鈉生理鹽水抽吸入注射器內(nèi)，然后繼續(xù)使用注射器抽入骨髓9ml，去掉針頭后，將肝素鈉生理鹽水和骨髓加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混合均勻后，得到骨髓懸液；

（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血150ml，置于血袋中，密封；

（3）、將患者的外周血分裝于50ml離心管中，每管45ml,在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，將上清離心30min，去沉淀，經(jīng)0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（4）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，在2000rpm的條件下，離心20min，然后吸取中間白膜層，然后向白膜層內(nèi)加入50mlpbs，并吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；

（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取15ml含自體血清和硫酸慶大霉素的dmem高糖培養(yǎng)基加入到目的細(xì)胞內(nèi)，然后將細(xì)胞吹打均勻，并計(jì)數(shù)，以5×10⁵/cm²接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基也含10%自體血清和40u/ml硫酸慶大霉素；

（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；

（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置在顯微鏡下，觀察到細(xì)胞回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞從瓶壁上脫落，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10⁸/l，將細(xì)胞接種于75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；

（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3周后，細(xì)胞傳代3次；

（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（12）、將細(xì)胞懸液離心7min，棄上清，再用pbs洗滌細(xì)胞3次；

（13）、細(xì)胞計(jì)數(shù)，向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml；

（14）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，取合適大小的無(wú)菌豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，糙面朝上，光面朝下放置于無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿中，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜；

（15）、將步驟（13）制備得到的細(xì)胞懸液滴入準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜上，細(xì)胞數(shù)約1×10⁶/cm²，繼續(xù)培養(yǎng)3天，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有40u/ml的硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（8）和步驟（12）中，離心轉(zhuǎn)速為1200rpm。

所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例2

本發(fā)明公開(kāi)了一種基質(zhì)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架的制備方法，具體步驟為：

（1）、在無(wú)菌條件下，使用20ml的注射器，將1ml肝素鈉生理鹽水抽吸入注射器內(nèi)，然后繼續(xù)使用注射器抽入骨髓9ml，去掉針頭后，將肝素鈉生理鹽水和骨髓加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混合均勻后，得到骨髓懸液；

（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血150ml，置于血袋中，密封；

（3）、將患者的外周血分裝于50ml離心管中，每管45ml,在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，將上清離心30min，去沉淀，經(jīng)0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（4）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，在2000rpm的條件下，離心20min，然后吸取中間白膜層，然后向白膜層內(nèi)加入50mlpbs，并吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；

（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取15ml含自體血清和硫酸慶大霉素的dmem高糖培養(yǎng)基加入到目的細(xì)胞內(nèi)，然后將細(xì)胞吹打均勻，并計(jì)數(shù)，以5×10⁵/cm²接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基也含10%自體血清和40u/ml硫酸慶大霉素；

（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；

（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于37℃，5%的co2溫箱3min后，倒置在顯微鏡下，觀察到細(xì)胞回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞從瓶壁上脫落，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后取含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10⁸/l，將細(xì)胞接種于75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；

（10）、細(xì)胞培養(yǎng)4周后，細(xì)胞傳代3次；

（11）、吸干培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，置于溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（12）、將細(xì)胞懸液離心7min，棄上清，再用pbs洗滌細(xì)胞3次；

（13）、細(xì)胞計(jì)數(shù)，向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml；

（14）、向dmem高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入自體血清和硫酸慶大霉素，dmem高糖培養(yǎng)基中的自體血清的體積濃度為10%，dmem高糖培養(yǎng)基中的硫酸慶大霉素的濃度為40u/ml，取合適大小的無(wú)菌豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，糙面朝上，光面朝下放置于無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿中，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜；

（15）、將步驟（13）制備得到的細(xì)胞懸液滴入準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜上，細(xì)胞數(shù)約1×10⁶/cm²，繼續(xù)培養(yǎng)3天，即可。

所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。

所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有40u/ml的硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（8）和步驟（12）中，離心轉(zhuǎn)速為1200rpm。

所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。