用于治療溶酶體貯積癥的腺伴隨病毒載體的制作方法

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本發(fā)明涉及用于所關(guān)注的蛋白質(zhì)的表達(dá)的載體以及它們?cè)诨蛑委熤械膽?yīng)用。本發(fā)明還涉及有助于治療粘多糖癥(mps)、特別是用于治療iii-b型粘多糖癥或sanfilippob綜合征的載體和核酸序列。

背景技術(shù)：

溶酶體是在動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器，動(dòng)物細(xì)胞在陳舊的細(xì)胞成分的再循環(huán)過(guò)程中或者在病毒和細(xì)菌被吞噬之后斷裂生物分子的超過(guò)50種的水解酶。這種細(xì)胞器包含多種類(lèi)型的水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂肪酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸酯酶。所有的酶均是酸水解酶。

溶酶體貯積癥(lsd)是由影響一種或多種溶酶體酶的遺傳缺陷引起的。這些遺傳疾病通常是由于溶酶體中存在的特定的酶活性的缺陷而導(dǎo)致的。在較低的程度而言，這些疾病可能是由于與溶酶體生源論有關(guān)的蛋白質(zhì)的缺陷。

lsd在個(gè)體中稀少，但是總體而言，這些疾病在總?cè)丝谥惺窍鄬?duì)普遍的。lsd的總和患病率(combinedprevalence)為每5000名活產(chǎn)嬰兒有大約1名嬰兒患病。參見(jiàn)meiklep,etal,jama1999；281:249-254。但是，總?cè)丝谥械囊恍┤后w特別受到高發(fā)生率的lsd的折磨。例如在jewishcentral和easterneuropean(ashkenazi)個(gè)體的后代中，gaucher和tay-sachs疾病的患病率分別為每600名活產(chǎn)嬰兒有1名嬰兒患病，和每3900名活產(chǎn)嬰兒有1名嬰兒患病。

已知統(tǒng)稱(chēng)為sanfilippo綜合征的iii型粘多糖癥(mpsiii)是由與糖胺聚糖(gag)硫酸乙酰肝素(hs)逐步降解有關(guān)的一種酶的缺陷而導(dǎo)致的lsd，從而引起糖胺聚糖(gag)硫酸乙酰肝素(hs)的病理學(xué)累積。根據(jù)酶的缺陷，mpsiii分成4種亞型。n-乙酰葡糖胺糖苷酶(α酶活性)的損失導(dǎo)致iiib亞型。所產(chǎn)生的疾病在臨床上表征為cns的兒童期性進(jìn)展性神經(jīng)病變。該臨床過(guò)程通?？梢苑殖?個(gè)階段。在該疾病的第一階段，在跨越生命的第一個(gè)月的無(wú)癥狀期后，精神發(fā)育的延緩變得明顯。其后在疾病的第二階段，發(fā)生嚴(yán)重的行為問(wèn)題和漸進(jìn)性的智力下降。最后，在嚴(yán)重的癡呆的發(fā)作下，行為問(wèn)題慢慢消失，并且所有的運(yùn)動(dòng)功能開(kāi)始下降，從而逐漸導(dǎo)致吞咽困難、移動(dòng)的完全喪失和椎體束損傷。除了神經(jīng)性癥狀以外，mpsiiib患者遭受非神經(jīng)學(xué)的改變，包括復(fù)發(fā)的耳、鼻、喉和胸的感染，頻繁腹瀉和便秘，進(jìn)行性關(guān)節(jié)退變和影響移動(dòng)性的骨骼異常，以及肝臟和脾腫大。參見(jiàn)clearyandwraith,archdischild.1993；69(3):403-6,neufeldandmuenzer,"themucopolysaccharidoses"inscriverc,etal,eds.,"themetabolicandmolecularbasisofinheriteddisease",mcgraw-hillpublishingco.,newyork,ny,us,2001,pp.3421-3452,vandekampetal,clingenet.181；20(2):152-60,moogetal,amjmedgenetcseminmedgenet.2007；145c(3):293-301?；颊咄ǔＴ谏牡诙€(gè)十年結(jié)束和第三個(gè)十年開(kāi)始時(shí)死亡。參見(jiàn)neufeldandmuenzer，如上。稱(chēng)為衰減顯性的、具有較晚發(fā)作和較長(zhǎng)生存的更緩慢進(jìn)行形式的疾病在mpsiiib患者的亞組中有所描述。參見(jiàn)moogetal,supraandvalstaretal,annneurol.2010；68(6):876-87。

目前對(duì)mpsiiib沒(méi)有可利用的治療。因此，所述的疾病的控制是根據(jù)癥狀的，并且目標(biāo)在于改善患者及其家人的生命的品質(zhì)。這對(duì)于由cns改變而產(chǎn)生的那些癥狀而言是特別重要的。例如間歇性顱內(nèi)壓增高是公認(rèn)的行為障礙的原因，并且其在mps中屢見(jiàn)不鮮。參見(jiàn)muenzeretal,genetmed.2006；8(8):465-73。由于粘多糖沉積而導(dǎo)致的腦膜增厚是腦脊液(csf)壓力增加的潛在原因。因此，當(dāng)行為改變是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)難以治愈時(shí)，考慮插入腦脊液分流術(shù)，以減輕壓力。在6名插入腦脊液分流術(shù)的sanfilippo患者中，神經(jīng)癥狀現(xiàn)在改善。參見(jiàn)robertsonetal,eurjpediatr.1998；157(8):653-5。另一方面，對(duì)于所述的疾病的睡眠障礙特征而言，認(rèn)為給予退黑激素是最佳的治療方法，但是其不是完全有效的。參見(jiàn)fraseretal,archdischild.2005；90(12):1239-42。對(duì)于身體病理學(xué)也沒(méi)有特定的治療，并且僅姑息性治療可以用于各個(gè)單獨(dú)的癥狀。

對(duì)新的mpsiiib治療方法進(jìn)行了測(cè)試，取得不同程度的成功。底物剝奪療法(sdt)目的在于降低gag合成的速率，這樣如果任何殘余的酶活性得到保持，便防止gag過(guò)多的累積，或者至少累積的速率減慢。已經(jīng)表明染料木黃酮(一種大豆異黃酮)通過(guò)降低表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)的激酶活性而起到hs生產(chǎn)抑制劑的作用。參見(jiàn)jakobkiewicz-baneckaetal,jbiomedsci.2009；16:26,piotrowskaetal,eurjhumgenet.2006；14(7):846-52。近來(lái)的研究表明在患有不同粘多糖癥(i、ii、iii-a和iii-b型)的患者的成纖維細(xì)胞中，染料木黃酮會(huì)抑制gag的合成。參見(jiàn)piotrowskaetal，如上。對(duì)mpsiiib小鼠模型短期和長(zhǎng)期口服給予染料木黃酮使得貯積減少，并且在運(yùn)動(dòng)技巧測(cè)試中表現(xiàn)良好。參見(jiàn)malinowskaetal,molgenetmetab.2009；98(3):235-42,malinowskaetal,plosone.2010；5(12):el4192。當(dāng)靜脈內(nèi)給予染料木黃酮時(shí)，預(yù)計(jì)其能夠穿越血腦屏障(bbb)，從而允許cns病理學(xué)的治療。支持這種概念的是，在一項(xiàng)開(kāi)放標(biāo)記初步研究中，在12個(gè)月內(nèi)對(duì)5名mpsiiia和5名mpsiiib患者給予富含染料木黃酮的大豆提取物，使得身體和神經(jīng)參數(shù)顯著改良。參見(jiàn)piotrowskaetal,currenttherapeuticresearch.2008；69(2):166-179。但是，隨后的研究未顯示在12個(gè)月內(nèi)使用染料木黃酮治療的mpsiiia、mpsiiib或mpsiiic患者的殘疾等級(jí)或行為得分有所改善。參見(jiàn)delgadilloetal,jinheritmetabdis.2011；34(5):1039-44；在thenetherlandsnationaltrialregister登記的研究ntpv#1826；以及deruijteretal,annneurol.2012；71(1):110-20。另一種分子若丹明b在臨床前研究中被證明能夠有效減少gag累積，并且具有與使用染料木黃酮所觀察到的相似效力。參見(jiàn)在www.mpssociety.co.uk上可獲得的hendrikszetal,"guidelinesfortheinvestigationandmanagementofmucopolysaccharidosistypeiii",2012。認(rèn)為若丹明b會(huì)通過(guò)抑制糖前體的形成和/或糖基轉(zhuǎn)移酶的活性而阻遏gag鏈的合成。參見(jiàn)robertsetal,molgenetmetab.2007；92(1-2):115-21。

正常細(xì)胞分泌大量的甘露糖-6-磷酸(m6p)-標(biāo)記的溶酶體酶，其隨后可以由其他細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜上的m6p受體吸收。這使得可能通過(guò)輸入正確形式的缺失酶而治療由可溶性水解酶的缺陷而引起的lsd。盡管酶替代治療(ert)還尚未用于sanfilippob患者，但是在3月齡的mpsiiib小鼠靜脈內(nèi)給予重組的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α顯示該重組酶分布于多個(gè)器官中，主要分布于肝臟中。在腦中檢測(cè)到了大量的酶，這是由于bbb的存在限制了對(duì)腦實(shí)質(zhì)而言為外源提供的蛋白質(zhì)的進(jìn)入。參見(jiàn)yuetal,molgenetmetab.2000；71(4):573-80andhendrikszetal，如上。有針對(duì)用于治療mpsiiib患者神經(jīng)疾病的ert產(chǎn)物的早期研發(fā)項(xiàng)目。hgt-3010項(xiàng)目(shire)為基于重組酶的鞘內(nèi)傳遞的ert，并且目前處于臨床前階段。在mpsiiia小鼠中直接遞送ert至cns會(huì)減少神經(jīng)病理學(xué)，并且目前正在mpsiiia患者中試驗(yàn)。參見(jiàn)www.clinicaltrials.gov上的hemsleyk,etal,genesbrainbehav.2008；53(2):161-8,savasp,etal,molgenetmetab.2004；82:273-285,nct01155778andncto1299727。然而，治療需要植入永久的鞘內(nèi)遞送裝置，這與大量的風(fēng)險(xiǎn)和缺點(diǎn)有關(guān)，并且治療本身的每位患者/年的經(jīng)濟(jì)成本極高。

已經(jīng)證明使用骨髓衍生的干細(xì)胞(骨髓移植，bmt)的造血干細(xì)胞移植(hsct)在患有其他mps的患者中能夠有效治療身體和神經(jīng)病理學(xué)。參見(jiàn)petersetal,blood1996；87(ll):4894-902,petersandsteward,bonemarrowtransplant2003；31(4):229-39andyamadaetal,bonemarrowtransplant1998；21(6):629-34。供者衍生的骨髓細(xì)胞能夠穿過(guò)bbb，進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，并分化為分泌缺失的溶酶體酶的小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后這些細(xì)胞被周?chē)募?xì)胞吸收，從而校正腦中g(shù)ag的累積。參見(jiàn)krivitetal,celltransplant.1995；4(4):385-92。然而，在經(jīng)歷bmt的sanfilippoa或b患者中，未觀察到明顯的益處。參見(jiàn)hoogerbruggeetal,lancet1995；345(8962):1398-402,vellodietal,jinheritmetabdis.1992；15(6):911-8,gtingorandtuncbilek,turkjpediatr.1995；37(2):157-63,sivakumurandwraith,jinheritmetabdis.1999；22(7):849-50andlangeetal,arqneuropsiquiatr.2006；64(l):l-4。bmt失敗的主要原因似乎是與原發(fā)性疾病的快速進(jìn)展相比，小膠質(zhì)細(xì)胞群體被造血細(xì)胞后代替代的步調(diào)緩慢。參見(jiàn)rovelli,bonemarrowtransplant2008；41suppl2:s87-9。因此，使用mbt的hsct目前沒(méi)有作為mpsiii患者的治療選擇。參見(jiàn)boelensetal,pediatrclinnortham.2010；57(1):123-145。使用臍帶血-衍生的干細(xì)胞的hsct會(huì)改善mpsiiib小鼠的認(rèn)知結(jié)果，但是需要重復(fù)的給予細(xì)胞。參見(jiàn)willingetal,celltransplantation2013；已經(jīng)線(xiàn)上發(fā)表。近來(lái)，該方法已經(jīng)用于移植患有mpsiiia和mpsiiib的多個(gè)孩子；其是否保護(hù)cns免于惡化仍尚不清楚。參見(jiàn)deruijteretal,currpharmbiotechnol.2011；12(6):923-30。

考慮到目前對(duì)mpsiii，特別是對(duì)mpsiiib的治療選擇的局限，需要備選的方法。體內(nèi)基因治療提供了對(duì)mpsiiib和其他遺傳病進(jìn)行單次治療的可能性，以及終生有益作用的前景。已經(jīng)在mpsiiib疾病的動(dòng)物模型中檢驗(yàn)了基于使用不同病毒載體并結(jié)合不同給予途徑的多種基因治療方法。

編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α基因的慢病毒載體已經(jīng)靜脈內(nèi)給予年輕的mpsiiib小鼠，從而產(chǎn)生在肝臟、脾、肺和心臟中低水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在這些組織中，所述酶會(huì)減少但不會(huì)使gag累積正常化。參見(jiàn)dinataleetal,biochemj.2005；388(2):639-46。還通過(guò)將慢病毒載體通過(guò)顱內(nèi)給予直接遞送至腦實(shí)質(zhì)中來(lái)檢驗(yàn)慢病毒載體的治療潛力。參見(jiàn)didomenicoetal,amjmedgeneta.2009；149a(6):1209-18。在單一的腦位點(diǎn)給予的mpsiiib小鼠在治療后達(dá)6個(gè)月顯示n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增加，這僅部分校正了溶酶體貯積損傷。

由于腺相關(guān)病毒(aav)載體的高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病原性的缺乏，所以腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移作為許多體內(nèi)基因治療用途的選擇方法而快速的出現(xiàn)。aav載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后的細(xì)胞，并且多個(gè)臨床前和臨床研究證明aav載體-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移高效地驅(qū)動(dòng)用于多種疾病的治療轉(zhuǎn)基因的持續(xù)表達(dá)的潛力。參見(jiàn)bainbridgeetal,nengljmed.2008；358(21):2231-9,hauswirthetal,humgenether.2008；19(10):979-90,maguireetal,nengljmed.2008；358(21):2240-8,niemeyeretal,blood2009；113(4):797-806,riveraetal,blood2005；！05(4):1424-30,nathawanietal,nengljmed.2011；365(25):2357-65andbuchlisetal,blood2012；119(13):3038-41。

當(dāng)編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的血清型2aav載體在單一的位置被傳遞至mpsiiib小鼠的腦實(shí)質(zhì)時(shí)，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的表達(dá)和活性局限于注射位點(diǎn)，并且僅取得疾病顯性的部分減輕。參見(jiàn)fuetal,molther.2002；5(l):42-9,cressantetal,jneurosci.2004；24(45):10229-39。在使用甘露醇預(yù)治療后，被靜脈內(nèi)傳遞至mpsiiib小鼠中的aav2載體得到顯著延長(zhǎng)的生存，改善的行為表現(xiàn)，以及減少的腦溶酶體病理學(xué)，但是僅取得身體疾病的部分校正。參見(jiàn)mccartyetal,genether.2009；16(11):1340-52。另一方面，通過(guò)腦池內(nèi)注射將aav2載體單一給予腦脊液(csf)中使得在mpsiiib小鼠的腦子儲(chǔ)存n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性和減少gag，但是在溶酶體組織中未觀察到可檢測(cè)的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。參見(jiàn)fuetal.,jgenemed.2010；12(7):624-33。涉及aav2的腦池內(nèi)和靜脈內(nèi)傳遞的組合治療證明在cns以及部分溶酶體的校正中顯著的長(zhǎng)期治療效力。參見(jiàn)fuetal,genether.2007；14(14):1065-77。

其他研究利用了在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給予后對(duì)由aav血清型5載體顯示的神經(jīng)元細(xì)胞的高嗜性。然而，這些載體在腦實(shí)質(zhì)中具有低的分布，并且所述的方法需要多次注射。將aav5載體傳遞至新生mpsiiib小鼠的腦的多給位點(diǎn)，并結(jié)合骨髓移植，顯示出與使用血清型2載體所得的相似的治療效力。參見(jiàn)heldermonetal,molther.2010；18(5):873-80。在腦的尺寸較大的動(dòng)物模型中，在mpsiiib狗中將aav5載體立體給予4個(gè)不同的腦的位置，得以在腦的廣泛區(qū)域檢測(cè)到活性n-乙酰葡糖胺糖苷酶α。然而，在大部分的吻部和大部分的尾部，特別是在小腦中，酶活性保持較低或不可檢測(cè)。參見(jiàn)ellinwoodetat,molther.2011；19(2):251-9。在治療的mpsiiib狗中，溶酶體病理學(xué)被改善，但是不能完全校正，表明使用所述的方法取得的酶活性的水平不足以處理gag貯積。盡管具有這種部分效力，但是近來(lái)開(kāi)始了基于該方法的臨床試驗(yàn)。參見(jiàn)在isrctn登記的isrctnl9853672。腦越大，越難以在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射的情況下覆蓋該器官的整個(gè)體積，并且傳遞至人類(lèi)需要在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行載體給予，使得傳遞在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)，而且需要研發(fā)特定的手術(shù)過(guò)程。參見(jiàn)souweidaneetal,jneurosurgpediatr.2010；6(2):115-122。

到目前位置，僅報(bào)告了一項(xiàng)使用血清型9的aav載體用于治療mpsiiib的研究。該方法利用了在系統(tǒng)給予aav9載體時(shí)，該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)cns的能力。參見(jiàn)foustetal,natbiotechnol.2009；27(l):59-65andduque,etal,molther.2009；17(7):1187-1196。將aav9-n-乙酰葡糖胺糖苷酶α載體靜脈內(nèi)傳遞至mpsiiib小鼠使得cns和身體器官中的溶酶體貯積病理學(xué)得到校正，行為表現(xiàn)得到改善并且壽命被延長(zhǎng)。參見(jiàn)fuetal,molther.2011；19(6):1025-33。然而，該建議的作用過(guò)程具有多個(gè)缺點(diǎn)。首先，所用的cmv啟動(dòng)子被報(bào)告為沉寂的。參見(jiàn)loseretal,jvirol.1998jan；72(l):180-90。第二，在極高劑量的載體(≥lx10¹³vg/kg)下取得治療效力。由制備和安全性的觀點(diǎn)來(lái)看，使用這種高劑量對(duì)臨床轉(zhuǎn)化提出了挑戰(zhàn)。

上述方法均不能完全恢復(fù)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性，在cns和身體組織中取得胞漿內(nèi)包涵體的完全根除，或者校正mpsiiib的所有臨床跡象。因此，需要治療mpsiiib的具有更高效力和安全性概況的新型方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于治療疾病、具體為治療iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的新的重組載體。

在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及腺相關(guān)病毒載體(aav)，其包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)seqidno:1的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的aav載體為血清型9(aav9)。這些載體證明極有效地完全恢復(fù)腦和身體組織的所有區(qū)域的病理學(xué)gag貯積。

根據(jù)本發(fā)明的aav9載體包含編碼naglu的核苷酸序列，該序列與seqidno:2具有至少80％序列一致性，并且優(yōu)選地與seqidno:2具有至少84％的序列一致性。

本發(fā)明的aav9載體進(jìn)一步包含與編碼的核苷酸序列連接的啟動(dòng)子，以便控制naglu的表達(dá)。合適的啟動(dòng)子為cag啟動(dòng)子seqidno:4。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及質(zhì)粒，其包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)的核苷酸序列，以及具體地與seqidno:2具有至少80％序列一致性或優(yōu)選地與seqidno:2具有至少84％序列一致性的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的治療有效量的aav9載體或本文所述的質(zhì)粒。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于傳遞多核苷酸、特別是naglu多核苷酸的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用作藥劑、特別是用于治療iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的本發(fā)明的aav9載體或本文所述的質(zhì)粒。

本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的aav9載體的方法。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分離的細(xì)胞，其包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)的核苷酸序列，以及具體地與seqidno:2具有至少80％序列一致性或優(yōu)選地與seqidno:2具有至少84％序列一致性的核苷酸序列。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(paav-cag-hnaglu)的質(zhì)粒的水動(dòng)力傳遞。使用50μg質(zhì)粒paav-cag-hnaglu以水動(dòng)力的方式注射2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠。柱狀圖描繪了在肝臟(a)和血清(b)中，在質(zhì)粒給予后的1周測(cè)量的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性。注射生理鹽水的wt小鼠的naglu活性設(shè)定為100％。值為每組3-4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與wt。

圖2.編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9載體的靜脈內(nèi)(iv)傳遞。野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-hnaglu處理的mpsiiib小鼠的肝臟(a)和血清(b)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(c)在身體器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與wt。$$$p<0.001與wt,**p<0.01,***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖3.編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9載體的靜脈內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-hnaglu處理的mpsiiib小鼠的腦(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在腦的相同部分中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖4.編碼優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9載體的靜脈內(nèi)傳遞。在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-cohnaglu處理的mpsiiib小鼠的肝臟(a)和血清(b)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在身體器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。$$$p<0.001與wt,**p<0.01,***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖5.編碼優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9載體的靜脈內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-cohnaglu處理的mpsiiib小鼠的腦(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在腦的相同部分中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖6.編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)(ic)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及腦池內(nèi)注射9.3x10⁹vgaav9-cag-hnaglu處理的mpsiiib小鼠的腦(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在相同的腦的區(qū)域中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖7.編碼人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及腦池內(nèi)注射9.3x10⁹vgaav9-cag-hnaglu處理的mpsiiib小鼠的肝臟中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在身體器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。$$$p<0.001與wt,**p<0.01,***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖8.編碼優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及腦池內(nèi)注射9.3x10⁹vgaav9-cag-cohnaglu處理的mpsiiib小鼠的腦(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在相同的腦的區(qū)域中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖9.編碼優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及腦池內(nèi)注射9.3x10⁹vgaav9-cag-cohnaglu處理的mpsiiib小鼠的肝臟中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在身體器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組5-8只小鼠的平均值±sem。$$$p<0.001與wt,**p<0.01,***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。

圖10.編碼優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α2型(paav-cag-cohnaglu-2型)的質(zhì)粒的水動(dòng)力傳遞。使用50μg質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu-2型以水動(dòng)力的方式注射2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠。柱狀圖描繪了在肝臟(a)和血清(b)中，在質(zhì)粒給予后的1周測(cè)量的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性。注射生理鹽水的wt小鼠的naglu活性設(shè)定為100％。值為每組3-4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與wt。

圖11.編碼優(yōu)化的人類(lèi)3型n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(paav-cag-cohnaglu-3型)的質(zhì)粒的水動(dòng)力傳遞。使用50μg質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu-3型以水動(dòng)力的方式注射2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠。柱狀圖描繪了在肝臟(a)和血清(b)中，在質(zhì)粒給予后的1周測(cè)量的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性。注射生理鹽水的wt小鼠的naglu活性設(shè)定為100％。值為每組3-4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與wt。

圖12.編碼優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。在向mpsiiib小鼠的小腦延髓池中給予3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu后載體基因組的生物分布。通過(guò)定量pcr在腦(a)和身體組織(b)中定量載體基因組，并且指二倍體基因組中所包含的dna的量。nd為未檢測(cè)。

圖13.編碼優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及小腦延髓池內(nèi)給予3.9x10¹⁰vg對(duì)照載體(aav9-null)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠的腦(i-v)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在相同的腦的區(qū)域中的糖胺聚糖(gag)的定量。值為每組4只小鼠的平均值±sem。**p<0.01,***p<0.001與mpsiiib-無(wú)效的。nd：未檢測(cè)。

圖14.編碼優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。(a)在野生型(健康)小鼠以及小腦延髓池給予3.9xl0¹⁰vg對(duì)照載體(aav9-無(wú)效的)或3x10¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠中，在針對(duì)溶酶體標(biāo)志物limp-2染色后在腦的不同區(qū)域中獲得的信號(hào)強(qiáng)度的定量，其給出了溶酶體間隔的尺寸的指示。值為每組4只小鼠的平均值±sem。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001與mpsiiib-無(wú)效的。(b)在野生型(左側(cè)面板)、未處理的mpsiiib(中間面板)和在小腦延髓池中給予aav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠(右側(cè)面板)的大腦皮質(zhì)和小腦的電子顯微鏡分析。1.神經(jīng)元；2.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；3.浦肯野神經(jīng)細(xì)胞。(c)由野生型(wt)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠(mpsiiib)和在小腦延髓池中給予3.9x10¹⁰vg對(duì)照載體(aav9-無(wú)效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠獲得的腦提取物中，其他溶酶體酶的活性。sgsh為n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶，gusb為葡萄糖苷酸酶β，hexb為氨基己糖苷酶b。wt酶活性設(shè)定為100％。值為每組4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001與mpsiiib-無(wú)效的。

圖15.編碼優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。柱狀圖表示在由野生型(健康)小鼠、以及在小腦延髓池中給予3.9x10¹⁰vg對(duì)照載體(aav9-無(wú)效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠得到的額極皮層、頂葉皮層、枕葉皮層、上丘和丘腦的切片中，在針對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物gfap(a)和針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物bsi-b4(b)的免疫染色后測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度。值為每組2-3只小鼠的平均值±sem。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001與mpsiiib-無(wú)效的。(c)基于基因本體(go)注釋的功能分類(lèi)。餅圖表明與各生物過(guò)程術(shù)語(yǔ)有關(guān)的文字部分。清楚而言，大部分的術(shù)語(yǔ)代表了炎癥/免疫力相關(guān)的類(lèi)別。(d)所有試驗(yàn)組的層次聚類(lèi)，其是基于一組基因，cten軟件分配這些基因以代表神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。各列代表基因，而各行代表動(dòng)物。在底部所示的灰度等級(jí)中，相對(duì)于跨越所有樣品的基因的平均豐度，來(lái)描繪各基因的表達(dá)水平。在矩陣上方所示的樣品的系統(tǒng)樹(shù)圖代表了轉(zhuǎn)錄物水平的總體相似度。清楚而言，使用aav9-cag-comnaglu處理的所有mpsiiib小鼠均具有接近于健康的年齡匹配的wt同窩幼畜的基因表達(dá)概況。

圖16.編碼優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。在野生型(健康)小鼠、未處理的mpsiiib小鼠以及在小腦延髓池中給予3.9x10¹⁰vg對(duì)照載體(aav9-無(wú)效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠的肝臟(a)和血清(b)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(c)身體器官中的糖胺聚糖(gag)定量。值為每組4-8只小鼠的平均值±sem。$p<0.05與wt,**p<0.01,***p<0.001與未處理的mpsiiib。nd：未檢測(cè)。(d)肝臟的電子顯微鏡分析。在由使用無(wú)效載體處理的mpsiiib小鼠得到的肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可以觀察到多個(gè)電-光亮空泡(箭頭)，并且這些在使用aav9-cag-mnaglu處理的動(dòng)物中，這些小泡消失。(e)在(a和b)中，由相同的一列動(dòng)物得到的肝臟提取物中其他溶酶體酶的活性。ids為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；idua為艾杜糖苷酸酶，α-l-；sgsh為n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶；gusb為葡萄糖苷酸酶β；hexb為氨基己糖苷酶b。wt酶的活性設(shè)定為100％。值為每組4只小鼠的平均值±sem。**p<0.01和***p<0.001與mpsiiib-無(wú)效。

圖17.編碼優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9載體的腦池內(nèi)傳遞。在天然檢驗(yàn)的野生型(健康)小時(shí)、未處理的mpsiiib小鼠和在小腦延髓池中給予3.9x10¹⁰vg對(duì)照載體(aav9-無(wú)效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠中的行為評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)相當(dāng)于在頭2分鐘過(guò)程中記錄的運(yùn)動(dòng)和探索活性，并且表示為每組10-15只動(dòng)物的平均值±sem。(a)向中心的潛伏，(b)在邊界的時(shí)間，(c)向中心的進(jìn)入，(d)休眠時(shí)間，(e)移動(dòng)的總距離，(f)穿越的線(xiàn)的總數(shù)。*p<0.05和**p<0.01與mpsiiib無(wú)效的。(g)在wt(n＝23)，未處理的mpsiiib小鼠(n＝12)，注射3.9xl0¹⁰vgaav9-null(n＝5)或3x10⁹vgaav9-cag-comnaglu(n＝8)的mpsiiib小鼠的kaplan-meier生存分析。使用aav9-cag-comnaglu基因治療進(jìn)行的處理大幅延長(zhǎng)了mpsiiib動(dòng)物的壽命。對(duì)于aav9-cag-comnaglu-處理的mpsiiib小鼠與mpsiiib-無(wú)效的，p＝0.0007。

圖18.編碼優(yōu)化的犬科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cocnaglu)的aav9載體向beagle狗的腦池內(nèi)傳遞。(a)在向健康的beagle狗csf內(nèi)傳遞aav9-cag-cocnaglu載體之前和之后，在匹配的血清和csf樣品中的抗aav9中和抗體(nab)效價(jià)的跟蹤。在腦池內(nèi)給予之前，通過(guò)靜脈內(nèi)傳遞1x10¹¹vg/kgaav9-無(wú)效的載體來(lái)預(yù)免疫狗3和4。(b)在csf內(nèi)給予編碼犬科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的6.5xl0¹²vgaav9載體后，在健康成年beagle狗的csf中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性的跟蹤。在給予時(shí)，狗1和2(空心符號(hào))是天然的，而狗3和4(實(shí)心符號(hào))對(duì)aav9載體具有預(yù)存在的免疫力。在相同的圖中描繪了所有狗的各時(shí)間點(diǎn)的csf白細(xì)胞計(jì)數(shù)(wbc)(虛線(xiàn))。

圖19.質(zhì)粒paav-cag-hnaglu(a)的示意圖和重組aav載體aav9-cag-hnaglu(b)的基因組的示意圖。

圖20.質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu(a)的示意圖和重組aav載體aav9-cag-cohnagiu(b)的基因組的示意圖。

圖21.質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu-2型(a)的示意圖和重組aav載體aav9-cag-cohnaglu-2型(b)的基因組的示意圖。

圖22.質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu-3型(a)的示意圖和重組aav載體paav-cag-cohnaglu-3型(b)的基因組的示意圖。

圖23.質(zhì)粒paav-cag-comnaglu(a)的示意圖和重組aav載體aav9-cag-comnaglu(b)的基因組的示意圖。

圖24.質(zhì)粒paav-cag-cocnaglu(a)的示意圖和重組aav載體aav9-cag-cocnaglu(b)的基因組的示意圖。

微生物有機(jī)體的保藏

質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu(seqidno:6)于2012年11月13日以登錄號(hào)dsm26626保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

質(zhì)粒paav-cag-hnaglu(seqidno:5)于2014年3月13日以登錄號(hào)dsm28568保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu-2型(seqidno:20)于2015年4月29日以登錄號(hào)dsm32042保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

質(zhì)粒paav-cag-cohnaglu-3型(seqidno:23)于2015年4月29日以登錄號(hào)dsm32043保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

定義

術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”是指核酸分子，dna或rna，其分別包含脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

核酸可以是雙鏈的、單鏈的，或者包含雙鏈的或單鏈的序列的部分。

術(shù)語(yǔ)“序列一致性％”是指在對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)以取得最大的序列一致性％之后，與參照序列中的核苷酸一致的候選序列的核苷酸的百分率。序列一致性％可以通過(guò)本領(lǐng)域建立的任何方法或算法測(cè)定，例如align,blast和blast2.0算法。參見(jiàn)altschuls,etnucacidsres.1977；25:3389-3402andaltschuls,etal,jmolbiol.1990；215:403-410。

在本文中，序列一致性％是通過(guò)將參照序列與候選序列比對(duì)后一致的核苷酸數(shù)量除以參照序列中核苷酸的總數(shù)量，并將所得的結(jié)果乘以100來(lái)計(jì)算的。

術(shù)語(yǔ)動(dòng)詞性的“編碼”或動(dòng)名詞性的“編碼”是指確定核苷酸序列翻譯成多肽或蛋白質(zhì)的方式的遺傳密碼子。序列中核苷酸的順序決定了沿著多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸的順序。

術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”是指由氨基酸或多肽的一個(gè)或多個(gè)線(xiàn)性鏈構(gòu)成的大分子。蛋白質(zhì)可以經(jīng)歷翻譯后修飾，例如半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)化成3-氧代丙氨酸、糖基化或金屬結(jié)合。蛋白質(zhì)的糖基化是加入不同的碳水化合物，其與氨基酸鏈共價(jià)連接。

術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以達(dá)到預(yù)期目的的物質(zhì)的量。例如增加n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性的aav9載體的有效量為足以減少糖胺聚糖累積的量。治療疾病或紊亂的表達(dá)載體的“治療有效量”為足以減輕或根除疾病或紊亂的跡象或癥狀的表達(dá)載體的量。給定物質(zhì)的有效量將隨著諸如物質(zhì)的本性、給藥的途徑、取得所述的物質(zhì)的動(dòng)物的尺寸和物種、以及給予所述的物質(zhì)的目的之類(lèi)的因素而改變。在各種個(gè)體情況下的有效量可以由技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域建立的方法憑經(jīng)驗(yàn)確定。

術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”是指哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人類(lèi)或非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為小鼠、大鼠、其他嚙齒動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、馬或靈長(zhǎng)動(dòng)物，進(jìn)一步更優(yōu)選的是人類(lèi)。

術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指啟動(dòng)子序列相對(duì)于所關(guān)注的基因的功能關(guān)系和位置(例如如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列可操作地連接)。通常，可操作地連接的啟動(dòng)子與所關(guān)注的序列是相鄰的。但是，增強(qiáng)子不一定與所關(guān)注的序列相鄰來(lái)控制它們的表達(dá)。

術(shù)語(yǔ)“嗜性”是指其中不同的病毒經(jīng)過(guò)演化從而優(yōu)選地靶向特定的宿主物種或者這些物種中特定的細(xì)胞類(lèi)型的方式。

術(shù)語(yǔ)“基因治療”是指所關(guān)注的遺傳材料(例如dna或rna)轉(zhuǎn)移至宿主中從而治療或預(yù)防遺傳性或獲得性疾病或狀況。所關(guān)注的遺傳材料編碼需要在體內(nèi)生產(chǎn)的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)多肽、肽或功能rna)。例如所關(guān)注的遺傳材料可以編碼酶、激素、受體或治療價(jià)值的多肽。

術(shù)語(yǔ)“重組病毒載體”、“病毒載體”、“重組載體”或“載體”是指由天然形成的病毒通過(guò)能夠?qū)⑺P(guān)注的遺傳材料(例如dna或rna)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的基因改造技術(shù)而得到的試劑，其使得由所述的遺傳材料編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)多肽、肽或功能rna)在靶細(xì)胞中生產(chǎn)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“重組載體”或“載體”應(yīng)該理解為用于將所述的遺傳材料轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的衣殼蛋白質(zhì)以及其中所包含的遺傳材料。通過(guò)核苷酸序列的“重組載體”或“載體”是指其基因組在相應(yīng)的序列列表(seqid)中列出的“重組載體”或“載體”。

術(shù)語(yǔ)“重組質(zhì)?！被颉百|(zhì)粒”是指通過(guò)能夠?qū)⑺P(guān)注的遺傳材料轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的遺傳改造技術(shù)而獲得的小型環(huán)狀雙鏈的自我復(fù)制dna分子，其使得由所述的遺傳材料編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)多肽、肽或功能rna)在靶細(xì)胞中生產(chǎn)。此外，術(shù)語(yǔ)“重組質(zhì)粒”或“質(zhì)?！边€是指通過(guò)在病毒載體的制備過(guò)程中作為重組載體基因組的載體而使用的遺傳改造技術(shù)所獲得的小型環(huán)狀雙鏈的自我復(fù)制dna分子。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于治療疾病、具體為治療iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的新的重組載體。

除了遺傳材料以外，重組載體還可以包含不同的功能元件，這些元件包括用于轉(zhuǎn)錄的控制元件(例如啟動(dòng)子或操縱子)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域或增強(qiáng)子，以及用于起始或終止翻譯的控制元件。

根據(jù)本發(fā)明的載體為用于轉(zhuǎn)移所關(guān)注的基因的腺相關(guān)載體(aav)。它們證明在廣泛的組織中在轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后的細(xì)胞中具有高的效力。在本發(fā)明的內(nèi)容中，所述的載體用于傳遞人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(hnaglu)多核苷酸(seqidno:2)或密碼子優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(cohnaglu)多核苷酸(seqidno:3)。腺相關(guān)載體為衍生自微小病毒科的腺相關(guān)病毒基因組的載體。腺相關(guān)病毒的基因組形成單鏈脫氧核糖核酸(ssdna)。這些載體感染哺乳動(dòng)物，但是為非病原性的(即，不導(dǎo)致疾病)。它們可以感染分裂細(xì)胞或非分裂細(xì)胞，并且它們的嗜性根據(jù)血清型而改變。血清型為根據(jù)病毒的衣殼抗原進(jìn)行的病毒組分類(lèi)。通過(guò)病毒衣殼蛋白質(zhì)確定的腺相關(guān)病毒的血清型定義了病毒的嗜性，并允許其進(jìn)入到特定類(lèi)型的細(xì)胞中。在本發(fā)明的內(nèi)容中，血清型9的腺相關(guān)病毒載體(aav9)顯示在單次給予時(shí)將遺傳材料傳遞至腦以及傳遞至外周器官的最佳能力。

本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，aav9衣殼與編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的核苷酸序列以及特定的cag啟動(dòng)子在相同的實(shí)體中的結(jié)合允許缺失的酶在腦的所有區(qū)域中持久地表達(dá)。結(jié)果是糖胺聚糖(gag)的溶酶體累積被校正，從而通過(guò)這種方式預(yù)防了mspiii疾病、具體為mpsmb的神經(jīng)系統(tǒng)改變的特征。這種效果甚至在嗅球中獲得，其為距給予載體位點(diǎn)的遠(yuǎn)端形式。此外，被傳遞至腦脊液中的根據(jù)本發(fā)明的aav9載體能夠到達(dá)系統(tǒng)性循環(huán)中，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)至肺。肺細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的酶使得血清中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增加，最終導(dǎo)致許多身體組織中溶酶體病理學(xué)減少。這表明根據(jù)本發(fā)明的載體超過(guò)現(xiàn)有方法的清晰的益處，其中所述的現(xiàn)有的方法僅部分校正了所述的疾病的臨床跡象，并且通常在腦或者在系統(tǒng)性循環(huán)中發(fā)揮它們的作用，但是不能在二者中發(fā)揮作用。

因此，本發(fā)明涉及重組aav9載體，其包含與編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列連接的cag啟動(dòng)子(seqidno:4)。

具體而言，本發(fā)明的重組aav9載體包含與編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列連接的cag啟動(dòng)子(seqidno:4)，其中所述的核苷酸序列與seqidno:2具有至少80％的序列一致性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的aav9重組載體包含與編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列連接的cag啟動(dòng)子(seqidno:4)，其中所述的核苷酸序列與seqidno:2具有至少84％的序列一致性。具體而言，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列與seqidno:2具有84％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組aav9載體包含與編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列連接的cag啟動(dòng)子(seqidno:4)，其中所述的核苷酸序列與seqidno:3具有至少85％的序列一致性。具體而言，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列與seqidno:3具有85％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:2。

在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:3。在seqidno:3中列出的序列呈現(xiàn)出與seqidno:2的84％的序列一致性。

在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:19。

在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:22。

根據(jù)本發(fā)明的aav載體包含控制所關(guān)注的基因翻譯和轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子為與所述的所關(guān)注的基因可操作地連接的核苷酸序列。在本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子為cag啟動(dòng)子，其是指包含巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子元件和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的組合的cag啟動(dòng)子。其進(jìn)一步包含β-球蛋白內(nèi)含子的一部分，其中所述的β-球蛋白內(nèi)含子賦予由所關(guān)注的基因衍生得到的mrna以穩(wěn)定性。參見(jiàn)alexopouloua,etal,bmccellbiology2008；9(2):1-11。在本發(fā)明的aav9載體中所包含cag啟動(dòng)子具有序列seqidno:4。具體而言，該cag啟動(dòng)子證明比本領(lǐng)域常用的cmv啟動(dòng)子是更高效的。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組的aav9載體選自aav9-cag-hnaglu(seqidno:9),aav9-cag-cohnaglu(seqidno:10),以及aav9-cag-cohnaglu-2型(seqidno:21)和aav9-cag-cohnaglu-3型(seqidno:24)。優(yōu)選地，重組aav9載體選自aav9-cag-hnaglu(seqidno:9),aav9-cag-cohnaglu(seqidno:10)。更特別地，本發(fā)明的重組aav9載體由血清型9的人類(lèi)腺相關(guān)病毒的病毒衣殼，以及包含人類(lèi)腺相關(guān)病毒血清型2的末端反向重復(fù)序列(itr)的修飾基因組、cag啟動(dòng)子、人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)基因的編碼序列(cds)和得自兔β-球蛋白基因的polya組成。

本發(fā)明還涉及包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列的質(zhì)粒。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其與seqidno:2具有至少80％的序列一致性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其與seqidno:2具有至少84％的序列一致性。具體而言，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列具有與seqidno:2的84％,87％,90％,95％,98％或99％序列一致性。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其與seqidno:3具有至少85％的序列一致性。具體而言，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列具有與seqidno:3的85％,87％,90％,95％,98％或99％序列一致性。

這些質(zhì)粒用于通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞而生產(chǎn)本發(fā)明的重組aav9載體。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的質(zhì)粒中所包含的并編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:2。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的質(zhì)粒中所包含的并編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:3。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的質(zhì)粒中所包含的并編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:19。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的質(zhì)粒中所包含的并編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列為seqidno:22。

在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的質(zhì)粒選自paav-cag-hnaglu(seqidno:5),paav-cag-cohnaglu(seqidno:6),paav-cag-cohnaglu-2型(seqidno:20)和paav-cag-cohnaglu-3型(seqidno:23)，并且特別地選自paav-cag-hnaglu(seqidno:5)和paav-cag-cohnaglu(seqidno:6)，并且優(yōu)選地，所述的質(zhì)粒為paav-cag-cohnaglu(seqidno:6)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的腺相關(guān)病毒重組載體aav9的方法。所述的工藝包含以下步驟：

i)提供第一載體，其包含設(shè)置在第一aav末端重復(fù)序列和第二aav末端重復(fù)序列之間的編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的序列，與編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的序列可操作地連接的cag啟動(dòng)子；提供第二載體，其包含得自血清型9的aavrep基因和aavcap基因；以及提供第三載體，其包含腺病毒輔助功能基因；

ii)使用步驟i)的載體共轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞；

iii)培養(yǎng)步驟ii)的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；以及

iv)純化由步驟iii)的培養(yǎng)物得到的表達(dá)載體。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一載體的aav第一和第二末端重復(fù)序列為得自aav血清型2的itr。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二載體的aavrep基因得自aav血清型2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，感受態(tài)細(xì)胞為hek293細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了用于制備根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟：

i)具體而言使用miui/ecori，通過(guò)消化來(lái)剪切由起始質(zhì)粒得到的編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的序列；

ii)克隆處于aav主鏈質(zhì)粒paav-cag的2個(gè)限制性位點(diǎn)之間的編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的序列，由此獲得相應(yīng)的質(zhì)粒，其包含編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的序列。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明考慮了藥物組合物，其包含本文所述的治療有效量的aav9載體，或者本文所述的治療有效量的。

本發(fā)明的藥物組合物在藥物可接受的載體中包含重組aav9載體。所述的組合物還可以包含至少一種輔助物質(zhì)?？梢栽谳d體、賦形劑、溶劑、稀釋劑或助劑中選擇輔助物質(zhì)?？山邮艿妮d體、稀釋劑或助劑是非毒性的，并且優(yōu)選地在所使用的劑量和濃度下是惰性的，而且包含緩沖劑，例如磷酸鹽,檸檬酸鹽或其他有機(jī)酸；抗氧化劑；低分子量多肽、蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白,凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物；氨基酸；單糖,二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖,甘露糖或糊精；螯合劑；糖醇，例如甘露醇或山梨醇,成鹽離子(例如鈉)；和/或非離子表面活性劑，例如聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(pluronic)聚乙烯醇(peg)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物適用于腸胃外給予。腸胃外給予的實(shí)例為靜脈內(nèi)、皮下、腦池內(nèi)和肌肉內(nèi)注射。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物適用于靜脈內(nèi)或腦池內(nèi)給予。適用于此類(lèi)腸胃外給予的組合物包括用于臨時(shí)制備無(wú)菌溶液或分散液的無(wú)菌水性溶液或分散液、無(wú)菌粉末。有利地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物免于細(xì)菌和真菌的污染作用。

用于人類(lèi)和動(dòng)物的每日劑量可以根據(jù)在各種物種中具有它們的基準(zhǔn)的多種因素或者諸如年齡、性別、重量或疾病程度等而改變。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及上文所述的aav9載體或上文所述的質(zhì)粒的治療用途。如上文所提及，根據(jù)本發(fā)明的重組aav9載體取得了缺失naglu酶的表達(dá)，因此校正了gag的溶酶體累積。這允許校正iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的所有臨床跡象。在這一方面中，本發(fā)明還涉及用作藥劑的上文所述的重組aav9載體或上文所述的質(zhì)粒。

具體而言，本發(fā)明涉及用于增加肌體中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的上文所述的重組aav9載體或上文所述的質(zhì)粒。

在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明設(shè)計(jì)及用于治療iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的上文所述的重組aav9載體或上文所述的質(zhì)粒。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于制備治療iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的藥劑的上文所述的重組aav9載體或上文所述的質(zhì)粒。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及治療iii型粘多糖癥(mpsiii)、特別是mpsiiib的方法，其包括將上文所述的至少重組aav9載體或上文所述的至少質(zhì)粒給予有需要的受試對(duì)象。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的細(xì)胞，其包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其與seqidno:2具有至少80％的序列一致性。優(yōu)選地，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列與seqidno:2具有至少84％的序列一致性。具體而言，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列與seqidno:2具有84％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。在另一個(gè)具體的方面中，編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列與seqidno:3具有至少85％的序列一致性，并且優(yōu)選地與seqidno:3具有至少85％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:2。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:3。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:19。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:22。

一般過(guò)程

1.重組aav載體

本文所述的aav載體是通過(guò)三重轉(zhuǎn)染得到的。制備載體所需的材料為：hek293細(xì)胞(表達(dá)e1基因)，提供腺病毒功能的輔助質(zhì)粒，提供得自血清型2的aavre基因和得自血清型9(aav9)的cap基因的質(zhì)粒，以及最后，具有aav2itr和所關(guān)注的構(gòu)造的主鏈質(zhì)粒。

為了生成表達(dá)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的aav載體，將人類(lèi)、鼠科或犬科的非優(yōu)化的或優(yōu)化的cds克隆至處于普遍的雜交cag啟動(dòng)子控制之下的aav主鏈質(zhì)粒中。

使用具有修飾的3種質(zhì)粒通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染而生成載體。參見(jiàn)matsushitat,etal,genether.1998；5:938-945andwrightj,etal,mol.ther.2005；12:171-178。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有血清型2aav的病毒itr(上文所述)；2)帶有aavrep2和cap9基因的質(zhì)粒；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayusoe,etal,genether.2010；17:503-510。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

根據(jù)本領(lǐng)域本領(lǐng)域公知的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的載體。

2.動(dòng)物

同族突變的c57b1/6jn-乙酰葡糖胺糖苷酶α缺陷型小鼠(mpsiiib)模型購(gòu)自thejacksonlaboratory(barharbor,me,usa.stock003827)。參見(jiàn)lietal,procnatlacadsci.1999；96(25):14505-10。感染的mpsiiib和健康對(duì)照小鼠由雜合的創(chuàng)始人繁殖。使用擴(kuò)增涵蓋靶突變的序列的pc分析，由尾部截取的樣品在基因組dna上測(cè)定基因型。各個(gè)正義和反義引物的序列為：正向引物：5'-gtcgtctcctggttctggac-3'(seqidno:13)，反向引物：5'-accacttcattctggccaat-3'(seqidno:14)，反向引物突變：5'-cgctttctgggctcagag-3'(seqidno:15)。對(duì)小鼠隨意喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的飲食(harlan,tekland)，并保持在12h的光-暗循環(huán)下(在9:00a.m.光照)。

3.編碼hnaglu的質(zhì)粒向小鼠的水動(dòng)力傳遞

就paav-cag-hnaglu,paav-cag-cohnaglu-2型和paav-cag-cohnaglu-3型質(zhì)粒的水動(dòng)力傳遞而言，使2個(gè)月齡的mpsiiib和野生型動(dòng)物通過(guò)鼠尾靜脈注射在<5秒內(nèi)接受總劑量50μg質(zhì)粒，其量等于10％的動(dòng)物體重。該技術(shù)使得主要在肝臟中的質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。參見(jiàn)liuetal,genether.1990；6(7):1258-66。作為對(duì)照，一組小鼠接受等量的生理鹽水溶液。在水動(dòng)力注射質(zhì)粒后的1周處死小鼠。如以下部分所述，收獲器官。

4.載體給予和樣品收集

就aav9-cag-comnaglu載體向小鼠的腦池內(nèi)傳遞而言，將總劑量3xl0¹⁰vg注射至2個(gè)月齡的mpsiiib動(dòng)物的小腦延髓池中。相似的一組動(dòng)物注射3.9xl0¹⁰vg對(duì)照非編碼(aav9-無(wú)效的)的載體。在5個(gè)月齡時(shí)，即，在給予載體后的3個(gè)月，麻醉小鼠，然后心臟灌輸10mlpbs，從而使得自組織的血液完全清澈。收集全腦和多個(gè)身體組織(包括肝臟、脾、胰腺、腎、肺、心臟、骨骼肌和睪丸)，并在液氮中冷凍，而且儲(chǔ)存在-80攝氏度下或浸漬于福爾馬林中，以用于隨后的組織學(xué)分析。

就aav9-cag-hnaglu和aav9-cag-cohnaglu載體的靜脈內(nèi)傳遞而言，2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠通過(guò)鼠尾靜脈注射接受總劑量5x10¹¹vg。在4個(gè)月齡時(shí)，即，在給予載體后2個(gè)月，處死小鼠，并按照上述段落所述收獲器官。

就aav9-cag-hnaglu和aav9-cag-cohnaglu載體的腦池內(nèi)傳遞而言，在2個(gè)月齡的mpsiiib動(dòng)物的小腦延髓池中注射總劑量9.3x10⁹vg。在4個(gè)月齡時(shí)，即，在給予載體后的2個(gè)月，處死小鼠，并按照上述段落所述收獲器官。

就aav9-cag-cocnaglu向狗的腦池內(nèi)傳遞而言，通過(guò)小腦延髓池注射將總劑量6.5x10¹²vg給予健康成年beagle狗。在給予naglu載體之前6周，使2種動(dòng)物接受1x10¹¹vg/kgaav9-無(wú)效載體的靜脈內(nèi)注射，從而使動(dòng)物對(duì)aav9預(yù)免疫。首先每周，然后每個(gè)月，收集csf和血清樣品，并儲(chǔ)存在-80℃下。

5.載體基因組拷貝數(shù)的定量

將組織(-100mg)在56℃下在400μl蛋白酶r溶液(0.2mg/ml)中過(guò)夜消化。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，通過(guò)提取由上清液分離總dna。將dna再次懸浮于蒸餾水中，并使用nanodropnd-1000(nanodrop,wilmington,de,usa)定量。使用不會(huì)擴(kuò)增內(nèi)源基因位點(diǎn)的、鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α轉(zhuǎn)基因特異性的引物和探針，通過(guò)定量實(shí)時(shí)pcr來(lái)測(cè)定20ng總dna中載體基因組的拷貝數(shù)。正向引物：5'-gccgaggcccagttctac-3'(seqidno:16)；反向引物：5'-ttggcgtagtccaggatgttg-3'(seqidno:17)；探針：5'-agcagaacagcagataccagatcaccc-3'(seqidno:18)。通過(guò)與參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較來(lái)確定最終的值，其中所述的參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是由用于aav載體生產(chǎn)的線(xiàn)性質(zhì)粒(添加至20ng非轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因組dna中)的系列稀釋建立的。

6.n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性和糖胺聚糖定量

在mili-q水中對(duì)肝臟和腦的樣品進(jìn)行超聲處理。所分析的血清是未處理的。如上文所述，使用4-甲基傘形酮衍生的熒光底物(moscerdamsubstrates,oegstgeest,nl)來(lái)測(cè)定n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。參見(jiàn)marshandfensom,clingenet.1985；27(3):258-262。將腦和肝臟活性水平對(duì)蛋白質(zhì)總量進(jìn)行歸一化，使用bradford蛋白質(zhì)測(cè)試進(jìn)行定量(bio-rad,hercules,ca,us)。血清水平對(duì)體積進(jìn)行歸一化。

就糖胺聚糖(gag)定量而言，將組織樣品稱(chēng)重，然后使用蛋白酶消化，通過(guò)離心和過(guò)濾使提取物澄清。使用軟骨素4-磷酸作為對(duì)照，使用blyscan硫酸化糖胺聚糖試劑盒(biocolor,carrickfergus,countyantrim,gb)在組織提取物中測(cè)定gag水平。將gag的水平對(duì)組織濕重進(jìn)行歸一化。

7.其他溶酶體酶的活性

在37℃下與4-甲基傘形酮-α-n-游離酸(glycosynth)溫育1h的15μg蛋白質(zhì)中測(cè)量idua活性。就ids活性而言，將15μg蛋白質(zhì)首先與4-甲基傘形酮基-α-l-游離酸-2-硫酸(oscerdamsubstrates)在37℃下溫育4h，然后在37℃下與得自牛睪丸的一池溶酶體酶(lebt-m2,moscerdamsubstrates)溫育第二個(gè)24h。按照之前所述測(cè)量sgsh。參見(jiàn)haurigotetal,jclininvest2013；123(8):3254-71。就gusb活性而言，將10μg蛋白質(zhì)與4-甲基傘形酮基-β-d-葡糖苷酸(sigma)在37℃下溫育1h。通過(guò)將0.1μg蛋白質(zhì)與4-甲基傘形酮基n-乙?；?β-d-葡糖苷酸(sigma)在37℃下溫育來(lái)測(cè)試hexb活性。在通過(guò)增加h而終止反應(yīng)后，使用flx800熒光劑(biotekinstruments)測(cè)量釋放的熒光。針對(duì)bradford(bio-rad)定量的總蛋白質(zhì)含量將所有的酶活性歸一化。

8.組織學(xué)分析

將組織在福爾馬林中固定12-24h，包埋在石蠟中，并切片。就身體組織中l(wèi)amp1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)而言，使石蠟切片在檸檬酸鹽緩沖劑ph6中經(jīng)歷熱誘導(dǎo)的抗原表位的修復(fù)，然后與以1:100稀釋的大鼠抗lamp1抗體(1d4b；santacruzbiotechnology,santacruz,ca,us)在4℃下溫育過(guò)夜，隨后與以1:300稀釋的生物素化的兔抗大鼠抗體(dako,glostrup,dk)溫育。就limp2在腦中的免疫組織化學(xué)檢測(cè)而言，將石蠟切片與以1:100稀釋的兔抗limp2抗體(nb400；novusbiologicals,littleton,co,usa)在4℃下過(guò)夜溫育，隨后與以1:300稀釋的生物素化的山羊抗兔抗體(31820；vectorlaboratories,burlingame,ca,usa)溫育。就腦樣品中的gfap免疫染色而言，將石蠟切片與以1:1000稀釋的兔抗gfap抗體(ab6673；abeam,cambridge,uk)在4℃下溫育過(guò)夜，隨后與1:300稀釋的生物素化的山羊抗兔抗體(31820；vectorlaboratories,burlingame,ca,usa)溫育。通過(guò)使用abc-peroxidase染色試劑盒(thermoscientific,waltham,ma,us)在1:100稀釋下插入切片來(lái)擴(kuò)增lamp1、limp2和gfap信號(hào)，并使用3,3-二氨基聯(lián)苯(sigma-aldrich,st.louis,mo,us)作為色原體進(jìn)行觀察。使用光學(xué)顯微鏡(eclipse90i；nikon,tokyo,jp)獲得明視野圖像。

為了將腦樣品中的小膠質(zhì)細(xì)胞染色，將石蠟切片與以1:100稀釋的bsi-b4凝集素(l5391；sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)在4℃下溫育過(guò)夜。使用3,3-二氨基聯(lián)苯(sigma-aldrich,st.louis,mo,us)作為色原體觀察bsi-b4信號(hào)。使用光學(xué)顯微鏡(eclipse90i；nikon,tokyo,jp)獲得明視野圖像。

使用theniselementsadvancedresearch2.20軟件，使用用于所有動(dòng)物的相同的信號(hào)閾值環(huán)境，在每只動(dòng)物的各個(gè)腦區(qū)的3-5個(gè)圖像(原始放大,x20)中定量limp2、gfap和bsi-b4信號(hào)。然后，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域的百分率，即，圖像中總組織區(qū)域上具有陽(yáng)性信號(hào)的區(qū)域(以像素計(jì))。

9.透射電子顯微鏡分析

通過(guò)超劑量的異氟烷處死小鼠(isofluo,labs.esteve,barcelona,es)，并通過(guò)下腔靜脈灌輸1ml25％戊二醛和2％多聚甲醛。將肺側(cè)葉(大約1mm³)和大腦皮層的一小部分切片，并在相同的固定劑中在4℃下溫育2小時(shí)。在冷的甲申酸鹽緩沖劑中洗滌后，將樣本在1％四氧化鋨中進(jìn)行后期固定，在水性乙酸雙氧鈾中染色，然后通過(guò)梯度乙醇系列脫水，并包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中。使用檸檬酸鉛染色由樹(shù)脂塊得到的超薄切片并在透射電子顯微鏡(h-7000；hitachi,tokyo,jp)中檢查。

10.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

將半個(gè)小鼠的腦(～250mg)進(jìn)行機(jī)械均化，并使用mirvanatm(ambion,lifetechnolo-gies)分離總的rna。合成cdna，隨后通過(guò)progenikabiopharma(spain)在thegenechipmousegene2.1st16陣列平板(affymetrix)中雜交；根據(jù)affymetrix推薦的方案和設(shè)備進(jìn)行樣品處理、雜交和掃描。使用expressionconsoletm工具，通過(guò)rma(robustmultiarray求平均值)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化，從而獲得log2轉(zhuǎn)換的歸一化值。過(guò)濾數(shù)據(jù)，從而使分析集中于已知的編碼序列上，從而得到26688改變的基因的原始列表，其隨后再次過(guò)濾，從而除去方差低于第75個(gè)百分點(diǎn)。該過(guò)程生成了6672個(gè)基因的工作列表。就差異化表達(dá)的基因而言，fdr(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)標(biāo)準(zhǔn)<0.1，并且建立80％的置信度。就聚類(lèi)分析而言，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并使用thej-expresspro軟件(jexpress.bioinfo.no)表示成熱點(diǎn)圖。使用genecodistool2.0(genecodis2.dacya.ucm.es)進(jìn)行功能分析。將陣列數(shù)據(jù)提交給arrayexpress數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/；登陸密碼e-mtab-2984)。

11.行為評(píng)估

通過(guò)開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估行為變化。將動(dòng)物置于亮燈室(41x41x30cm)的左下角。在3個(gè)同心正方形中分割競(jìng)技場(chǎng)的表面：中心(14x14cm)，外周(27x27cm)和邊緣(41x41cm)。使用視頻跟蹤系統(tǒng)(smartjunior,panlab)，在最初的2分鐘內(nèi)記錄試驗(yàn)行為和一般活性?？偸窃谝惶斓耐瑫r(shí)(9:00am至1:00pm)進(jìn)行檢驗(yàn)，從而減小日周期的影響。

12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的結(jié)果表示為平均值±sem。使用單因素anova進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，并且使用dunnett后檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組和處理組之間的多重比較。如果p<0.05，則考慮具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用kaplan-meier方法來(lái)分析生存以及用于比較的log-rank檢驗(yàn)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：

實(shí)施例1：paav-cag-hnaglu的構(gòu)建

人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α編碼序列(cds)用作起始材料(ncbi參照序列：nm000263)，并進(jìn)行化學(xué)合成以用于所述的目的(geneart；lifetechnologies)。接受在質(zhì)粒pma(ampr)內(nèi)克隆的cds，其中所述的質(zhì)粒pma在5'和3'的側(cè)翼分別為mlul和ecori限制性位點(diǎn)。通過(guò)mlui/ecori消化來(lái)切割n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds，然后克隆至aav主鏈質(zhì)粒paav-cag(ampr)的mlul和ecori限制性位點(diǎn)之間。所得的質(zhì)粒稱(chēng)為paav-cag-hnaglu(登錄號(hào)dsm28568)。參見(jiàn)seqidno:5和圖19a。

之前已經(jīng)生成paav-cag質(zhì)粒，并包含得自aav2基因組的itr、cag啟動(dòng)子和得自兔β-球蛋白的polya信號(hào)、以及用于克隆所關(guān)注的cds的多克隆位點(diǎn)。cag啟動(dòng)子為雜交啟動(dòng)子，其由cmv早期/中期增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子構(gòu)成。該啟動(dòng)子能夠普遍地驅(qū)動(dòng)有效的表達(dá)。參見(jiàn)sawickijetal,expercellres.1998；244:367-369,huangjetal,jgenemed.2003；5:900-908,liuyeial,expmolmed.2007；39(2):170-175。

實(shí)施例2：aav9-cag-hnaglu的生產(chǎn)

使用具有修飾的3種質(zhì)粒，通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染來(lái)生成載體aav9-cag-hnaglu(seqidno:9和圖19b)。參見(jiàn)matsushita,1998(如上)和wright,2005,如上。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有aav2itr(paav-cag-hnaglu)；2)帶有aav2rep和aav9cap基因的質(zhì)粒(prep2cap9)；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的方案或優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayuso,2010,如上。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

實(shí)施例3：paav-cag-cohnaglu的構(gòu)建

設(shè)計(jì)并獲得包含優(yōu)化形式的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds(cohnaglu)的表達(dá)盒。通過(guò)以下過(guò)程優(yōu)化序列從而使人類(lèi)中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效力最大：刪除隱蔽剪切位點(diǎn)和rna不穩(wěn)定序列元件，以便增加rna的穩(wěn)定性；加入rna穩(wěn)定序列元件；密碼子優(yōu)化和g/c含量調(diào)試；避免穩(wěn)定的rna二級(jí)結(jié)構(gòu)，等其他變化。將所接受的優(yōu)化的cds克隆于pma-rq(ampr)質(zhì)粒中，其中所述的質(zhì)粒的5'和3'側(cè)翼分別為mlul和ecori限制性位點(diǎn)。

使用mlul和ecori消化pma-rq-cohnaglu質(zhì)粒，從而切割優(yōu)化的n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds。隨后，將該片段克隆至paav-cag主鏈質(zhì)粒的相同的限制性位點(diǎn)之間，從而生成paav-cag-cohnaglu質(zhì)粒(登錄號(hào)dsm26626)。參見(jiàn)seqidno:6和圖20a。

實(shí)施例4：aav9-cag-cohnaglu的生產(chǎn)

使用具有修飾的3種質(zhì)粒，通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染來(lái)生成載體aav9-cag-cohnaglu(seqidno:10和圖20b)。參見(jiàn)matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有aav2itr(paav-cag-cohnaglu)；2)帶有aav2rep和aav9cap基因的質(zhì)粒(prep2cap9)；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的方案或優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayuso,2010,如上。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

實(shí)施例5：paav-cag-cohnaglu-2型的構(gòu)建

設(shè)計(jì)并獲得包含人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds的第二優(yōu)化形式(cohnaglu-2型)的表達(dá)盒。接受在質(zhì)粒pj208(ampr)中克隆的優(yōu)化的cds(dna2.0@)，其中所述的質(zhì)粒分別在5'和3'的側(cè)翼具有mlul和ecori限制性位點(diǎn)。

使用mlui和ecori消化pj208-cohnaglu-2型質(zhì)粒，從而切除優(yōu)化的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α-2型cds。隨后，將該片段克隆至paav-cag主鏈質(zhì)粒的相同的限制性位點(diǎn)之間，從而生成paav-cag-cohnaglu-2型質(zhì)粒(登陸號(hào)dsm32042)。參見(jiàn)seqidno:20和圖21a。

實(shí)施例6：aav9-cag-cohnagiu-2型的生產(chǎn)

使用具有修飾的3種質(zhì)粒，通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染來(lái)生成載體aav9-cag-cohnaglu-2型(seqidno:21和圖21b)。參見(jiàn)matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。參見(jiàn)matsushita,1998,如上,和wright,2005,如上。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有aav2itr(paav-cag-cohnaglu-2型)；2)帶有aav2rep和aav9cap基因的質(zhì)粒(prep2cap9)；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的方案或優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayuso,2010,如上。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

實(shí)施例7：paav-cag-cohnaghi-3型的構(gòu)建

設(shè)計(jì)并獲得包含人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds的第三優(yōu)化形式(cohnaglu-3型)的表達(dá)盒。接受在質(zhì)粒puc57(ampr)中克隆的優(yōu)化的cds(genscript,inc)，其中所述的質(zhì)粒分別在5'和3'的側(cè)翼具有mlul和ecori限制性位點(diǎn)。

使用mlui和ecori消化puc57-cohnaglu-3型質(zhì)粒，從而切除優(yōu)化的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α-3型cds。隨后，將該片段克隆至paav-cag主鏈質(zhì)粒的相同的限制性位點(diǎn)之間，從而生成paav-cag-cohnaglu-3型質(zhì)粒(登陸號(hào)dsm32043)。參見(jiàn)seqidno:23和圖22a。

實(shí)施例8：aav9-cag-cohnagiu-3型的生產(chǎn)

使用具有修飾的3種質(zhì)粒，通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染來(lái)生成載體aav9-cag-cohnaglu-3型(seqidno:24和圖22b)。參見(jiàn)matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有aav2itr(paav-cag-cohnaglu-3型)；2)帶有aav2rep和aav9cap基因的質(zhì)粒(prep2cap9)；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的方案或優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayuso,2010,如上。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

實(shí)施例9：paav-cag-comnaglu的構(gòu)建

用于鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(ncbi參照序列：nm_013792)的cds經(jīng)歷序列優(yōu)化(geneart；lifetechnologies)。接受在質(zhì)粒pma-rq(ampr)中克隆的優(yōu)化的cds，其中所述的質(zhì)粒分別在5'和3'的側(cè)翼具有mlul和ecori限制性位點(diǎn)。

由pma-rq質(zhì)粒上切除mlui/ecori優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds片段，并隨后克隆至aav主鏈質(zhì)粒paav-cag的mlui和ecori限制性位點(diǎn)之間。所得的質(zhì)粒稱(chēng)為paav-cag-comnaglu。參見(jiàn)seqidno:7和圖23a。

實(shí)施例10：aav9-cag-comnagiu的生產(chǎn)

使用具有修飾的3種質(zhì)粒，通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染來(lái)生成載體aav9-cag-comnaglu(seqidno:11和圖23b)。參見(jiàn)matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有aav2itr(paav-cag-comnaglu)；2)帶有aav2rep和aav9cap基因的質(zhì)粒(prep2cap9)；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的方案或優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayuso,2010,如上。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

實(shí)施例11：paav-cag-cocnaglu的構(gòu)建

用于鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(ncbi參照序列：xm_548088.4)的cds經(jīng)歷序列優(yōu)化(geneart；lifetechnologies)。接受在質(zhì)粒pma-rq(ampr)中克隆的優(yōu)化的cds，其中所述的質(zhì)粒分別在5'和3'的側(cè)翼具有mlul和ecori限制性位點(diǎn)。

由pma-rq質(zhì)粒上切除mlui/ecori優(yōu)化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds片段，并隨后克隆至aav主鏈質(zhì)粒paav-cag的mlui和ecori限制性位點(diǎn)之間。所得的質(zhì)粒稱(chēng)為paav-cag-cocnaglu。參見(jiàn)seqidno:8和圖24a。

實(shí)施例12：aav9-cag-cocnaglu的生產(chǎn)

使用具有修飾的3種質(zhì)粒，通過(guò)hek293細(xì)胞的輔助無(wú)病毒轉(zhuǎn)染來(lái)生成載體aav9-cag-cocnaglu(seqidno:12和圖24b)。參見(jiàn)matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在裝有dmem(補(bǔ)充10％fbs)的旋轉(zhuǎn)瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中將細(xì)胞培養(yǎng)至70％融合，然后使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染：1)帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒，其中所述的表達(dá)盒的側(cè)翼具有aav2itr(paav-cag-cocnaglu)；2)帶有aav2rep和aav9cap基因的質(zhì)粒(prep2cap9)；以及3)帶有腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。如上文所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的方案或優(yōu)化的方案通過(guò)2個(gè)連續(xù)的氯化銫梯度來(lái)純化載體。參見(jiàn)ayuso,2010,如上。將載體針對(duì)pbs透析，過(guò)濾，通過(guò)qpcr滴定，并儲(chǔ)存在-80℃下，直至使用。

實(shí)施例13：質(zhì)粒paav9-cag-hnaglu的水動(dòng)力傳遞

通過(guò)水動(dòng)力鼠尾靜脈(hdtv)注射將總劑量為50μg的包含野生型人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α表達(dá)盒的質(zhì)粒paav9-cag-hnaglu給予2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠。該技術(shù)靶向傳遞至肝臟的質(zhì)粒的表達(dá)。參見(jiàn)liuetal,genether.1990；6(7):1258-66。

在質(zhì)粒傳遞后一周，在給予野生型人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α編碼質(zhì)粒的所有動(dòng)物的肝臟和血清中，記錄n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性大幅高出處理前的水平。參見(jiàn)圖1a和1b。在注射生理鹽水溶液的mpsiiib動(dòng)物中未檢測(cè)到活性。在處理動(dòng)物的肝臟和血清中觀察到的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的水平分別相當(dāng)于wt動(dòng)物的肝臟和血清中測(cè)量的平均活性值(設(shè)定為100％)的150％和1700％。參見(jiàn)圖1a和1b。

實(shí)施例14：aav9-cag-hnaglu的靜脈內(nèi)傳遞

通過(guò)鼠尾靜脈注射，將總劑量為5x10¹¹的aav9-cag-hnaglu載體的載體基因組給予2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠。

與aav9載體對(duì)肝臟的高嗜性一致，在給予后的2個(gè)月，經(jīng)處理的動(dòng)物顯示該器官中高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(其為健康動(dòng)物中所觀察的活性的700％)，這完全消除或大幅減少在未處理的mpsiiib小鼠的身體組織中所觀察到的gag的病理學(xué)累積。參見(jiàn)圖2a-c。此外，考慮到血清型9的aav載體在系統(tǒng)性給予時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)至腦中的高效率，經(jīng)處理的動(dòng)物顯示在所分析的所有腦區(qū)，都具有顯著水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(健康小鼠的20-30％)。參見(jiàn)圖3a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的這種部分恢復(fù)足以清除腦的所有區(qū)域的gag貯積。參見(jiàn)圖3b。

實(shí)施例15：aav9-cag-cohnaglu的靜脈內(nèi)傳遞

通過(guò)鼠尾靜脈注射，將總劑量為5x10¹¹的aav9-cag-hnaglu載體的載體基因組給予2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠。

在給予后的2個(gè)月，經(jīng)處理的小鼠顯示肝臟中高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(健康水平的600％)，并且在血清中活性水平適度增加。參見(jiàn)圖4a和4b。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的生產(chǎn)完全消除或大幅減少在未處理的mpsiiib小鼠的身體組織中所觀察的gag的病理學(xué)累積。參見(jiàn)圖4c。此外，經(jīng)處理的小鼠顯示在所分析的所有腦區(qū)中，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性顯著增加(健康小鼠的18-27％)。參見(jiàn)圖5a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的這種部分恢復(fù)足以清除所有腦區(qū)的gag貯積。參見(jiàn)圖5b。

實(shí)施例16：aav9-cag-hnaglu的腦池內(nèi)傳遞

將總劑量為9.3x10⁹的aav9-cag-hnaglu載體的載體基因組注射至2個(gè)月齡的mpsiiib動(dòng)物的小腦延髓池中，總量為5μl。

csf內(nèi)給予aav9-cag-hnaglu載體導(dǎo)致所分析的所有腦區(qū)中高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α水性(健康小鼠的50-100％)；在腦的最前部，活性達(dá)到健康動(dòng)物中所觀察到的水平。參見(jiàn)圖6a。在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的腦中，完全消除gag的過(guò)量貯積。參見(jiàn)圖6b。當(dāng)血清型9的aav載體被傳遞至csf中時(shí)，其滲漏至血流中，并轉(zhuǎn)導(dǎo)至肝臟。參見(jiàn)haurigotetal,jclininvest2013；123(8):3254-71。與此一致的是，在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的肝臟中檢測(cè)到n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性，其水平為健康動(dòng)物的32％。參見(jiàn)圖7a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性的這種增加介導(dǎo)了肝臟、脾、心臟、肺、睪丸和膀胱中g(shù)ag累積的校正，并且還顯著地減少腎中g(shù)ag的貯積。參見(jiàn)圖7b。

實(shí)施例17：aav9-cag-cohnaglu的腦池內(nèi)傳遞

將總劑量為9.3x10⁹的aav9-cag-cohnaglu載體的載體基因組注射至2個(gè)月齡的mpsiiib動(dòng)物的小腦延髓池中，總量為5μl。

腦池內(nèi)給予aav9-cag-cohnaglu載體導(dǎo)致所分析的所有腦區(qū)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性水性(為健康值的22-45％)大幅升高。參見(jiàn)圖8a。因此，在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的所有腦區(qū)中，gag的病理學(xué)累積完全恢復(fù)。參見(jiàn)圖8b。在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的肝臟中，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性也升高，達(dá)到健康動(dòng)物的25％。參見(jiàn)圖9a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的這種升高介導(dǎo)了肝臟、心臟、肺和膀胱中g(shù)ag累積的校正，并且還顯著減少gag在脾、睪丸和腎中的貯積。參見(jiàn)圖9b。

實(shí)施例18：質(zhì)粒paav9-cag-cohnaglu-2型的水動(dòng)力傳遞

將總劑量為50μg的帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒paav9-cag-cohnaglu-2型通過(guò)鼠尾靜脈的水動(dòng)力注射給予2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠，其中所述的表達(dá)盒包含人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的優(yōu)化形式(2型)。如上文提及，該技術(shù)將傳遞質(zhì)粒的表達(dá)靶向于肝臟。參見(jiàn)liuetal，如上。

在質(zhì)粒傳遞后一周，在接受水動(dòng)力注射質(zhì)粒的所有動(dòng)物的肝臟和血清中，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增高超過(guò)處理前的水平，其中所述的質(zhì)粒包含n-乙酰葡糖胺糖苷酶α編碼序列的優(yōu)化形式2型。參見(jiàn)圖10a和10b。在注射生理鹽水溶液的mpsiiib動(dòng)物中，未檢測(cè)到活性。在經(jīng)處理的動(dòng)物中，肝臟和血清的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性分別達(dá)到在wt動(dòng)物中所觀察到的平均活性值(設(shè)定為100％)的150％和1500％。參見(jiàn)圖10a和10b。

實(shí)施例19：質(zhì)粒paav9-cag-cohnaglu-3型的水動(dòng)力傳遞

將總劑量為50μg的質(zhì)粒plasmidpaav9-cag-cohnaglu-3型通過(guò)鼠尾靜脈的水動(dòng)力注射給予2個(gè)月齡的mpsiiib小鼠，其中所述的質(zhì)粒包含密碼子優(yōu)化形式(3型)的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α表達(dá)盒。如上文提及，該技術(shù)將傳遞質(zhì)粒的表達(dá)靶向于肝臟。參見(jiàn)liuetal，如上。

在質(zhì)粒傳遞后一周，在給予帶有表達(dá)盒的質(zhì)粒的所有動(dòng)物的肝臟和血清中，記錄到n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性大幅升高，超過(guò)處理前的水平，其中所述的表達(dá)盒包含密碼子優(yōu)化的人類(lèi)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α編碼序列的3型。參見(jiàn)圖11a和11b。在注射生理鹽水溶液的mpsiiib動(dòng)物中，未檢測(cè)到活性。在經(jīng)處理的動(dòng)物的肝臟和血清中所觀察到的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性水平分別相當(dāng)于在wt動(dòng)物的肝臟和血清中所測(cè)定的平均活性值(設(shè)定為100％)的170％和1100％。參見(jiàn)圖11a和11b。

實(shí)施例20：aav9-cag-comnaglu的腦池內(nèi)傳遞

將總劑量為3x10¹⁰的aav9-cag-comnaglu載體的載體基因組注射至2個(gè)月齡的mpsiiib動(dòng)物的小腦延髓池中，總量為10μl。

在所分析的所有腦區(qū)中以及在骨髓中可以檢測(cè)aav9載體基因組。在外周組織中，僅在肝臟中可以檢測(cè)到相當(dāng)大的基因拷貝數(shù)的載體基因組，而在其中頭部切開(kāi)引流(drain)的淋巴結(jié)(下頜淋巴結(jié))中檢測(cè)到較低的基因拷貝數(shù)。參見(jiàn)圖12a-b。

csf內(nèi)給予aav9-cag-comnaglu載體導(dǎo)致所分析的所有腦區(qū)中極高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α水性；達(dá)到比健康動(dòng)物的所有區(qū)域中所觀察到的活性水平高幾倍的水平。參見(jiàn)圖13a。在載體傳遞后3個(gè)月，在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的腦中，如gag累積的歸一化以及所分析的所有腦區(qū)中溶酶體標(biāo)志物limp-2+的信號(hào)強(qiáng)度所示，疾病的溶酶體病理學(xué)特征得到恢復(fù)。參見(jiàn)圖13b和14a。通過(guò)透射電子顯微鏡對(duì)枕葉皮質(zhì)和小腦進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析證明溶酶體病理學(xué)減少，其在皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中是極明顯的，所述的細(xì)胞在接受對(duì)照載體的mpsiiib動(dòng)物中顯示腫脹的且充滿(mǎn)較大的貯積小泡，而所述的細(xì)胞在使用aav9-cag-comnaglu處理的動(dòng)物中具有正常的外觀。參見(jiàn)圖14b。在lsd中，繼發(fā)于正常溶酶體動(dòng)態(tài)平衡的微擾，可以改變多種溶酶體酶(除了直接受到遺傳突變影響的那些以外)的活性。參見(jiàn)sardielloetal,science.2009；325:473-477。在5個(gè)月齡的未處理的或無(wú)效處理的雄性mpsiiib小鼠的腦中，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids),n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(sgsh),β-葡萄糖苷酸酶(gusb),andβ-氨基己糖苷酶(hexb)的活性顯著升高。參見(jiàn)圖14c。與在csf內(nèi)傳遞aav9-cag-comnaglu載體后3個(gè)月所觀察到的gag貯積減少一致的是，在經(jīng)處理的動(dòng)物中，腦sgsh、gusb和hexb的活性返回至健康野生型水平。參見(jiàn)圖14c。

與溶酶體病理學(xué)校正一致的是，在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的腦中，所有的炎癥的跡象消失。用于檢測(cè)星形細(xì)胞增生(gfap)和膠質(zhì)細(xì)胞增生(bsi-b4)的染色的信號(hào)強(qiáng)度類(lèi)似于經(jīng)處理的mpsiiib小鼠和健康動(dòng)物中的情況，這與未處理的mpsiiib小鼠中記錄的信號(hào)相反，其中所述的未處理的mpsiiib小鼠顯示神經(jīng)性炎癥的這些標(biāo)志物的明顯的上調(diào)節(jié)。參見(jiàn)圖15a和15b。為了進(jìn)一步評(píng)估csf內(nèi)aav9-cag-comnaglu基因治療對(duì)cns炎癥的效力，使用微陣列平臺(tái)進(jìn)行對(duì)總rna(分離自wt以及aav9-cag-comnaglu或aav9-null-處理的mpsiiib腦髓)的基因表達(dá)概況的研究。在數(shù)據(jù)處理和過(guò)濾后，在所述的3組中，發(fā)現(xiàn)94個(gè)基因差異性的表達(dá)。當(dāng)geneontology(go)富集分析用于分類(lèi)由生物過(guò)程產(chǎn)生的差異性表達(dá)的基因時(shí)，使用相應(yīng)的本體論注釋94個(gè)基因中的67個(gè)基因。參見(jiàn)圖15c。其中，絕大多數(shù)與以下方面有關(guān)：炎癥和先天免疫力或可以有助于與這些過(guò)程有關(guān)的細(xì)胞的功能。參見(jiàn)圖15c。為了證明這種觀察，我們使用celltypeenrichment(cten)分析來(lái)評(píng)估不同細(xì)胞類(lèi)型對(duì)所觀察到的轉(zhuǎn)錄物水平的變化的幫助。該軟件考慮如果軟件定義的得分大于2，則特異性細(xì)胞類(lèi)型富集。對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞而言，得到我們數(shù)據(jù)組的最高得分(得分＝60)，其結(jié)果與有助于神經(jīng)退行性疾病和mpsiii中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的重要作用一致。參見(jiàn)ohmietal,procnatlacadsciusa.2003；100:1902-1907,mcgeeretalalzheimerdisassocdisord.1998；12(suppl.2):s1-e16,dereckietal,nature.2012；484:105-109,dirosarioetal,jneuroscires.2009；87:978-990,archer,etal,jinheritmetabdis.2014；37:1-12。當(dāng)評(píng)價(jià)aav9-cag-comnaglu載體的csf內(nèi)傳遞的作用時(shí)，觀察到基因表達(dá)概況相對(duì)于注射aav9-無(wú)效的動(dòng)物的顯著的改變。在載體給予后3個(gè)月，在經(jīng)處理的mpsiiib小鼠中，絕大多數(shù)的基因具有類(lèi)似于健康的同窩幼畜的轉(zhuǎn)錄物水平。在未處理的mpsiiib小鼠中差異性表達(dá)的幾乎90％的基因均顯示在aav9-cag-comnaglu處理后，它們的轉(zhuǎn)錄物水平校正至少50％，并且60％的基因校正為75％。當(dāng)單獨(dú)分析cten軟件將其指定為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一組基因時(shí)，觀察到轉(zhuǎn)錄物水平相似的或稍微高的歸一化程度。參見(jiàn)圖15d。該觀察支持以下想法：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞很大程度形成了mpsiiib中所觀察到的基因表達(dá)的概況，并且與經(jīng)處理的動(dòng)物中所記錄的膠質(zhì)細(xì)胞增生的完全逆轉(zhuǎn)一致。

給予csf的aav載體滲漏至外周并轉(zhuǎn)導(dǎo)至肝臟。參見(jiàn)圖9和haurigotetal，如上。因此，在使用aav9-cag-comnaglu處理的mpsiiib小鼠的肝臟和血清中記錄n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增加，達(dá)到了在健康動(dòng)物中所觀察到的水平的大約800％。參見(jiàn)圖16a和16b。血清中酶活性的水平與經(jīng)處理的小鼠的肝臟中的活性水平良好地相關(guān)，表明肝臟是循環(huán)酶的主要來(lái)源。當(dāng)通過(guò)不同器官中的gag含量的定量來(lái)評(píng)價(jià)治療的身體效力時(shí)，在大部分的組織中觀察到完全的歸一化，包括肝臟、脾、心臟和肺(其中觀察到gag減少>50％)，但是除了腎以外。參見(jiàn)圖16c。在不同的試驗(yàn)組中，肝臟的超微結(jié)構(gòu)分析顯示貯積空泡完全消失，這是使用aav9-cag-comnaglu處理的mpsiiib小鼠的肝細(xì)胞得到的mpsiiib疾病的特征。參見(jiàn)圖16d。如cns中所觀察的那樣，貯積材料由溶酶體間隔的清除導(dǎo)致其他溶酶體酶的活性的恢復(fù)。在未處理的或無(wú)效-處理的mpsiiib小鼠的肝臟中，α-艾杜糖苷酸酶(idua),艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids),sgsh,gusb和hexb的活性改變。參見(jiàn)圖16e。在aav介導(dǎo)的naglu基因轉(zhuǎn)移后3個(gè)月，所有這些酶的活性返回至正常水平，進(jìn)一步支持以下概念：通過(guò)aav9-cag-comnaglu的naglu的csf基因轉(zhuǎn)移還可以逆轉(zhuǎn)外周器官中的疾病顯型。參見(jiàn)圖16e。

通過(guò)開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估csf內(nèi)給予aav9-cag-comnaglu對(duì)行為的影響，其評(píng)價(jià)在未知環(huán)境中小鼠的一般運(yùn)動(dòng)和探索活性。在進(jìn)入中心的潛力、時(shí)間、在邊界的消耗、進(jìn)入中心的數(shù)量、停留的時(shí)間、移動(dòng)的總距離、穿越的線(xiàn)的數(shù)量，未處理的和aav-無(wú)效處理的mpsiiib小鼠展現(xiàn)處比健康小鼠降低的探索活性。腦池內(nèi)給予aav9-cag-comnaglu完全校正行為缺陷。參見(jiàn)圖17a-f。

此外，使用aav9-cag-comnaglu的處理會(huì)顯著地延長(zhǎng)mpsiiib小鼠的壽命。到15個(gè)月齡，所有的未處理的mpsiiib小鼠均死亡，而接受腦池內(nèi)aav9-cag-comnaglu的100％的動(dòng)物在18個(gè)月齡時(shí)仍存活。參見(jiàn)圖17g。與aav9-無(wú)效的mpsiiib雄鼠的13.8個(gè)月的中位生存期相比，處理的mpsiiib雄鼠顯示21個(gè)月的中位生存期，p＝0.0007。健康雄鼠的中位生存期為26.6個(gè)月。行為應(yīng)答的歸一化和經(jīng)處理的mpsiiib小鼠的更長(zhǎng)的生存期進(jìn)一步證明aav9-gag-comnaglu的治療效力。

實(shí)施例21：aav9-cag-cocnaglu向狗的腦池內(nèi)傳遞

邁向基因治療方法的臨床應(yīng)用的第一步需要證明其在大型動(dòng)物模型中的可行性。我們之前證明在腦脊液內(nèi)給予beagle狗(腦的尺寸接近人類(lèi)腦尺寸的動(dòng)物模型)時(shí)aav載體的分布與通過(guò)相同途徑接受等劑量載體的小鼠中所觀察的分布相似。參見(jiàn)haurigotetal，如上。簡(jiǎn)言之，給予編碼報(bào)告蛋白質(zhì)gfp的2x10¹³vgaav9載體證明細(xì)胞在腦、小腦、腦膜、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中的廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)。與在小鼠中形成的觀察類(lèi)似，在beagle狗的肝臟中還檢測(cè)到gfp，其中平均3.7％的肝細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)haurigotetal，如上。重要的是，csf內(nèi)給予編碼溶酶體酶硫酸胺酶(其缺陷導(dǎo)致mpsiiia)的aav9載體使得經(jīng)處理的狗的csf的酶保持持續(xù)的水平。csf浸漬cns，使得所述的酶可以利用于不同的cns結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，重組酶周期性地傳遞至csf為目前臨床研究下用于mpsiiia的治療策略。參見(jiàn)nct01155778和ncto1299727,clinicaltrials.gov。

相同的方法已經(jīng)用于說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的aav9載體的潛在效力。

將總劑量6.5x10¹²vg的aav9-cag-cocnaglu載體給予4只beagle狗(狗1-4)的小腦延髓池中。為了評(píng)價(jià)現(xiàn)有的免疫力對(duì)n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(可以通過(guò)所述的處理取得)的csf水平的影響，在csf傳遞前6周，通過(guò)系統(tǒng)性給予1x10¹¹vg/kg非編碼的aav9-無(wú)效載體來(lái)免疫這些狗中的2只(狗3和狗4)。在進(jìn)行腦池內(nèi)給予載體時(shí)，天然的狗在循環(huán)和csf中具有較低效價(jià)的抗-aav9中和抗體(nab)，這可以由事先未暴露于野生型或重組病毒的動(dòng)物而預(yù)計(jì)。相反，預(yù)免疫的狗在循環(huán)中具有較高的nab效價(jià)，但是在csf中具有低水平的效價(jià)，該觀察與穿越血-腦屏障的nab的非系統(tǒng)性分布一致。參見(jiàn)圖18a和haurigotetal，如上。向小腦延髓池給予aav9-cag-cocnaglu載體使得在得自所有4只狗的csf樣品中測(cè)量的酶活性顯著升高，并且與現(xiàn)有免疫力的存在或缺如不具有顯著性差異。參加圖18b。酶活性水平在第2周和第3周達(dá)到峰值，并且此后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的水平。重要的是，csf中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性的這種升高是長(zhǎng)期的(>4個(gè)月)。參見(jiàn)圖18b。

序列表

<110>埃斯蒂維實(shí)驗(yàn)室股份有限公司

巴塞羅那自治大學(xué)

<120>用于治療溶酶體貯積癥的腺伴隨病毒載體

<130>pct2212.5

<150>ep14382171

<151>2014-05-14

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