物具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性。在一個方面，本發(fā)明 的胰島素衍生物具有改善的物理穩(wěn)定性。在一個方面，本發(fā)明的胰島素衍生物具有改善的 化學(xué)和物理穩(wěn)定性。
[0030] 在一個方面，相對于人胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有改善的化學(xué)和/或物 理穩(wěn)定性。在一個方面，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的胰島素衍生物，本發(fā)明的胰 島素衍生物具有改善的化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性。
[0031] 本文所用的術(shù)語"物理穩(wěn)定性"是指，蛋白暴露于熱-機(jī)械應(yīng)激和/或與使之不穩(wěn) 定的界面和表面如疏水表面和界面的相互作用導(dǎo)致的胰島素衍生物形成蛋白的無生物活 性的和/或不溶性的聚集體的趨勢。因此，物理不穩(wěn)定性涉及相對于人胰島素的構(gòu)象變化， 其包括更有序結(jié)構(gòu)的損失，聚集，原纖化（fibrillation)，沉淀和/或吸附至表面。已知肽 如胰島素傾向于例如原纖化導(dǎo)致的不穩(wěn)定。通過在不同溫度不同時間期間將填充合適的容 器（例如，盒或小瓶）的溶液暴露于機(jī)械/物理應(yīng)激（例如攪動）之后例如目視檢查、比濁 法和/或濁度測定法的常規(guī)方法，可以評價包含胰島素衍生物的溶液的物理穩(wěn)定性。在具 有黑背景的尖銳聚焦光中進(jìn)行溶液的目視檢查。通過例如在從〇到3的等級（顯示無濁度 的溶液對應(yīng)于目測評分〇,顯示目測濁度的溶液對應(yīng)于目測評分3)排序濁度的程度的目 測評分而表征溶液的濁度。當(dāng)溶液在日光下顯示目測濁度時，對于蛋白聚集，溶液被分類為 物理不穩(wěn)定的?；蛘?，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的簡單的濁度測定評價溶液的濁度。也 可以通過使用胰島素衍生物的構(gòu)象狀態(tài)的光譜試劑或探針評價胰島素衍生物的物理穩(wěn)定 性。探針優(yōu)選與蛋白的非天然構(gòu)象優(yōu)先結(jié)合的小分子。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個 例子是硫磺素T。硫磺素T是已經(jīng)廣泛用于淀粉樣原纖維的檢測的熒光染料。在原纖維和 還可能其它蛋白構(gòu)型存在的情況下，當(dāng)結(jié)合于原纖維蛋白形式時，硫磺素T產(chǎn)生在約450nm 的新的最大激發(fā)和在約482nm的增強(qiáng)的發(fā)射。未結(jié)合的硫磺素T在該波長基本上無熒光。 如實(shí)施例109中所述測定本發(fā)明的胰島素衍生物的物理穩(wěn)定性。
[0032] 可以使用其它小分子作為蛋白結(jié)構(gòu)從天然至非天然狀態(tài)的變化的探針。例如，優(yōu) 先結(jié)合于蛋白的暴露的疏水補(bǔ)丁的"疏水性補(bǔ)丁"探針。疏水性補(bǔ)丁通常埋在天然狀態(tài)的 蛋白的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)，但當(dāng)?shù)鞍组_始解折疊或變性時變得暴露。這些小分子的光譜探針的例 子是芳族的疏水性染料，如蒽，吖啶，菲咯啉等。其它光譜探針是金屬-氨基酸復(fù)合物，如疏 水性氨基酸如苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸或等的鈷金屬復(fù)合物。
[0033] 本文所用的胰島素衍生物的術(shù)語"化學(xué)穩(wěn)定性"是指導(dǎo)致化學(xué)降解產(chǎn)物的形成的 蛋白結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價變化，與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比，該化學(xué)降解產(chǎn)物具有潛在的更低的生 物學(xué)效力和/或潛在的增加的免疫原性特性，其涉及避免共價鍵的降解如水解，外消旋，氧 化或交聯(lián)。根據(jù)天然蛋白的類型和性質(zhì)和胰島素衍生物暴露的環(huán)境，可以形成各種化學(xué)降 解產(chǎn)物。化學(xué)降解的消除最可能不能完全避免，在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白制劑的儲存 和使用期間經(jīng)常看到逐漸增加的化學(xué)降解產(chǎn)物。大多數(shù)蛋白傾向于脫酰胺化，在該過程中 谷氨酰胺或天冬酰胺殘基中的側(cè)鏈酰胺基被水解形成游離的羧酸。天冬酰胺和天冬氨酸殘 基可以進(jìn)一步形成isoAsp降解產(chǎn)物。其它降解途徑涉及形成高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中兩個 或更多的蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用而彼此共價結(jié)合，導(dǎo)致形成 共價結(jié)合的二聚體，寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物（Stability of Protein Pharmaceuticals， Ahern. T. J. &Manning M. C. , Plenum Press，New York 1992)。（例如甲硫氨酸殘基的）氧 化和外消旋可以作為化學(xué)降解的另一種變體被提及?？梢酝ㄟ^在暴露于不同的環(huán)境條件之 后在各個時間點(diǎn)測定化學(xué)降解產(chǎn)物的量評價胰島素衍生物的化學(xué)穩(wěn)定性（例如升高的溫 度經(jīng)?？梢约铀俳到猱a(chǎn)物的形成）。通過根據(jù)分子大小和/或電荷分離降解產(chǎn)物，例如，使 用色譜（例如，SEC-HPLC，RP-HPLC或IE-HPLC)和光譜方法（各種質(zhì)譜方法），有時與化學(xué) /酶片段化的組合，測定個別降解產(chǎn)物。
[0034] 在一個實(shí)施方案中，當(dāng)如實(shí)施例中所述測試時，相對于沒有一個或多個額外的二 硫鍵的胰島素衍生物的化學(xué)穩(wěn)定性，本發(fā)明的胰島素衍生物具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性。
[0035] 在一個實(shí)施方案中，當(dāng)如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且例如實(shí)施例101中所述檢測疏 水性時，相對于人胰島素和/或沒有一個或多個額外的二硫鍵的胰島素衍生物的親水性， 本發(fā)明的胰島素衍生物具有增加的親水性。
[0036] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物具有很少或沒有聚集的趨勢。當(dāng)在硫 磺素測定中試驗(yàn)時，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的人胰島素和/或胰島素衍生物 的聚集趨勢，聚集趨勢優(yōu)選顯著改善。
[0037] 在一個方面，本發(fā)明的胰島素衍生物具有改善的熱力學(xué)穩(wěn)定性，如例如，折疊穩(wěn)定 性，構(gòu)象的穩(wěn)定性和/或更高的熔解溫度。
[0038] 當(dāng)本文使用時，如果與沒有一個或多個額外的二硫鍵的人胰島素和/或胰島素衍 生物相比，所述衍生物的變性需要更高的應(yīng)激水平如更高的溫度和/或更高濃度的變性 劑，那么胰島素衍生物被稱為具有改善的"熱力學(xué)穩(wěn)定性"。
[0039] 可以通過如例如 Hudson 和 Andersen，Peptide Science，vol 76 (4)， pp. 298-308(2004)中所述圓二色光譜和NMR評價構(gòu)象的穩(wěn)定性。熔解溫度被理解為胰島 素結(jié)構(gòu)可逆或不可逆地變化的溫度。更高的熔解溫度對應(yīng)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)?？梢裕?，通 過圓二色光譜和/或NMR將構(gòu)象穩(wěn)定性評價為溫度的函數(shù)，或通過差示掃描量熱法而測 定熔解溫度。也可以在逐漸增加濃度的變性劑如例如鹽酸胍存在的情況下通過CD光譜 和或NMR測定熱力學(xué)穩(wěn)定性?？梢詮倪@種實(shí)驗(yàn)測定以前所述（Kaarsholm，N. C.，等，1993， Biochemistry，32,10773-8)的解折疊的自由能。蛋白變性后，遠(yuǎn)UV范圍（240-218-nm) 內(nèi)的負(fù)CD逐漸減小，與伴隨蛋白解折疊的有序的二級結(jié)構(gòu)的損失一致（Holladay等， 1977, Biochim. Biophys. Acta，494, 245-254 :Melberg 和 Johnson，1990, Biochim. Biophys. Acta，494，245-254)。在近UV范圍（330-250-nm)內(nèi)的胰島素CD譜反映了具有來自 二硫鍵的貢獻(xiàn)的酪氨酸發(fā)色團(tuán)的環(huán)境（Morris等，1968, Biochim. Biophys. Acta.，160， 145-155 ：ffood 等，1975, Biochim. Biophys.Acta,160,145-155 :Strickland&Mercola, 1976, Biochemistry, 15, 3875-3884)。從這些研究以前計算的胰島素的解折疊的自由能為 4. 5kcal/mol (Kaarsholm，N. C.，等，1993, Biochemistry, 32,10773-8)。
[0040] 在近UV范圍（330-250-nm)內(nèi)的胰島素⑶譜反映了具有來自二硫鍵的貢獻(xiàn)的 酪氨酸發(fā)色團(tuán)的環(huán)境。由于酪氨酸殘基是胰島素二聚體表面的部分，在該區(qū)域（尤是在 276nm)的摩爾橢圓率（molar elipticity)的變化反映在胰島素的結(jié)合狀態(tài)上。測量胰島 素的結(jié)合狀態(tài)的另一種方式是通過在本領(lǐng)域已知并且在實(shí)施例中描述的非解離條件下應(yīng) 用大小排阻色譜法。
[0041] 相對于母體胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有基本上相同或增加的體內(nèi)效力。 在一個方面，相對于母體胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有基本上相同的體內(nèi)效力。在一 個方面，相對于母體胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有增加的體內(nèi)效力。
[0042] 用于測定胰島素體內(nèi)效力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括實(shí)施例中所 述的試驗(yàn)，如：本發(fā)明的胰島素衍生物相對于人胰島素的效力，靜脈內(nèi)穩(wěn)態(tài)夾鉗試驗(yàn)如大鼠 藥代動力學(xué)和在腸內(nèi)注射后的大鼠PK，血糖降低效應(yīng)和靜脈內(nèi)大鼠PK試驗(yàn)。
[0043] 相對于母體胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有基本上相同或增加的體外效力。 在一個方面，相對于母體胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有基本上相同的體外效力。在一 個方面，相對于母體胰島素，本發(fā)明的胰島素衍生物具有增加的體外效力。
[0044]用于測定胰島素體外效力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，尤其包括下面的 體外試驗(yàn)：
[0045] (1)胰島素放射受體試驗(yàn)，其中將胰島素的相對效力定義為替代特異性結(jié)合于細(xì) 胞膜，例如大鼠肝質(zhì)膜部分上存在的胰島素受體的50%的1251_胰島素所需的胰島素和胰 島素衍生物的比例；
[0046] (2)脂肪生成試驗(yàn)，例如用大鼠脂肪細(xì)胞進(jìn)行，其中將相對的胰島素效力定義為實(shí) 現(xiàn)[3_ 3H]葡萄糖向有機(jī)可提取的材料（即脂質(zhì)）的最大轉(zhuǎn)化的50%所需的胰島素和胰島 素衍生物的比例；和
[0047] (3)在分離的脂肪細(xì)胞中的葡萄糖氧化試驗(yàn)，其中將胰島素衍生物的相對效力定 義為實(shí)現(xiàn)葡萄糖-1_[ 14C]向[14C02]的最大轉(zhuǎn)化的50%的胰島素和胰島素衍生物的比例。
[0048] 通過兩個硫醇基的偶聯(lián)得到二硫鍵，二硫鍵在本文理解為兩個硫原子之間的連 接，即具有整體連接R-S-S-R的結(jié)構(gòu)。二硫鍵也可以被稱為連接性二硫鍵、SS-鍵或二硫鍵 (disulfide bridges)。通過將兩個半胱氨酸氨基酸殘基引入肽并且隨后將兩個硫醇基氧 化為一個二硫鍵而產(chǎn)生二硫鍵。這種氧化可以化學(xué)地進(jìn)行（如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的）或 者可以，例如在酵母中，胰島素表達(dá)期間發(fā)生。
[0049]當(dāng)將半胱氨酸殘基引入沒有一個或多個額外的二硫鍵的胰島素衍生物時，半胱氨 酸殘基位于折疊的胰島素類似物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于人胰島素中的一個或多個 額外的二硫鍵的形成。例如，如果放置兩個新的半胱氨酸殘基，三維結(jié)構(gòu)中新的半胱氨酸殘 基的鄰近使得在兩個新的半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵。
[0050] 通過如，例如實(shí)施例中所述的準(zhǔn)確的完整質(zhì)量測量，可以容易地測定蛋白（如胰 島素）中二硫鍵的