4H，B16H，B10E，B16E，B25H，B25A，B25N，B27E，B27P， desB27 和 B28E。
[0086] 在本發(fā)明的一個方面，除了半胱氨酸取代以外，本發(fā)明的胰島素衍生物包含選自 如下的一個或多個氨基酸：B28E，B28D，desB27和A14E。
[0087] 在本發(fā)明的一個方面，除了半胱氨酸取代以外，本發(fā)明的胰島素衍生物包含選自 如下的一個或多個氨基酸：B3K，B29E，B27E，B27D，desB27, B28E，B28D，B28K 和 B29P。
[0088] 在本發(fā)明的一個方面，除了半胱氨酸取代以外，本發(fā)明的胰島素衍生物包含連接 B-鏈的C-末端和A-鏈的N-末端（以形成所謂的單鏈的胰島素衍生物）的C-肽。在本發(fā) 明的一個實施方案中，母體胰島素選自單鏈胰島素類似物。在本發(fā)明的一個實施方案中，母 體胰島素選自W02007096332, W02005054291或W02008043033 (該專利都通過引用特異性地 并入本文）中所列的單鏈胰島素類似物。
[0089] 在本發(fā)明的一個方面，獲得了胰島素衍生物，所述胰島素衍生物包含兩個半胱氨 酸取代，產(chǎn)生相對于人胰島素的一個額外的二硫鍵。
[0090] 本發(fā)明"胰島素（an insulin) "在本文被理解為人胰島素，desB30人胰島素或胰 島素類似物。
[0091] 本文所用的術(shù)語"胰島素肽"是指是人胰島素，desB30人胰島素或具有胰島素活性 的其類似物或衍生物的肽。
[0092] 本文所用的術(shù)語"胰島素類似物"是指修飾的胰島素，其中已經(jīng)用其他氨基酸殘基 取代了胰島素的一個或多個氨基酸殘基和/或其中已經(jīng)從胰島素缺失了一個或多個氨基 酸殘基和/或已經(jīng)將一個或多個氨基酸殘基增加和/或插入到胰島素。
[0093] 在一個方面，本發(fā)明的胰島素衍生物是包含相對于人胰島素的一個或多個額外的 二硫鍵并且包含連接于分子的B-鏈中存在的賴氨酸殘基的e氨基的側(cè)鏈的胰島素類似物 (如上所定義）。
[0094]術(shù)語"胰島素衍生物"意圖是指已經(jīng)被化學(xué)地衍生化的胰島素（如上所定義）。這 意味著側(cè)鏈（如本文所定義）已經(jīng)偶聯(lián)于胰島素。在最廣泛的意義上，側(cè)鏈可以是任何種 類的，如PEG，但是，更優(yōu)選地，側(cè)鏈包含脂肪酸或脂肪二酸部分。
[0095]本文所用的術(shù)語"母體胰島素"意圖是指具有一個或多個額外的二硫鍵的胰島素， 即在用側(cè)鏈衍生化之前具有一個或多個額外的二硫鍵的人胰島素，desB30人胰島素或胰島 素類似物。
[0096]本文所用的術(shù)語"沒有一個或多個額外的二硫鍵的胰島素衍生物"意圖是指具 有天然存在于人胰島素中的三個二硫鍵的胰島素衍生物，即在A-鏈的7位的半胱氨酸和 B-鏈的7位的半胱氨酸之間的第一橋連，在A-鏈的20位的半胱氨酸和B-鏈的19位的半 胱氨酸之間的第二橋連和在A-鏈的6位和11位的半胱氨酸之間的第三橋連以及連接于胰 島素但沒有進(jìn)一步的二硫鍵/橋連的側(cè)鏈。
[0097]本文使用的術(shù)語"側(cè)鏈"，其意圖是指（任選地通過一個或多個接頭）偶聯(lián)至本發(fā) 明的母體胰島素，如偶聯(lián)至母體胰島素的B-鏈中存在的賴氨酸的e氨基的脂肪酸或二酸。 側(cè)鏈的脂肪酸或二酸部分賦予對血清白蛋白的親和力，接頭的作用或修飾（例如，增加）對 白蛋白的親和力，修飾胰島素衍生物的溶解性，和/或調(diào)節(jié)（增加/減少）胰島素衍生物對 胰島素受體的親和力。
[0098]在一個方面，本發(fā)明的胰島素衍生物是包含至少兩個半胱氨酸取代的胰島素類 似物，其中胰島素類似物在胰島素肽的一個或多個氨基酸中?；?br>[0099]本文中，術(shù)語"?；囊葝u素"包括通過接頭將一個或多個?；糠峙c胰島素連接 的人胰島素或胰島素類似物的修飾。
[0100] 例如，在W0 2009/115469 A1中發(fā)現(xiàn)了可以通過本發(fā)明的半胱氨酸取代而修飾的 ?；囊葝u素類似物形式的胰島素衍生物的非限制性的例子。
[0101] 在一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物是修飾的胰島素，其中已經(jīng)用半胱氨 酸殘基取代兩個氨基酸殘基，已經(jīng)引入側(cè)鏈，任選地，相對于人胰島素的氨基酸序列，B30位 的氨基酸已經(jīng)缺失。
[0102] 在一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物包括側(cè)鏈和相對于人胰島素的2-9個 突變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者本發(fā)明的胰島素衍生物包括側(cè)鏈和相 對于人胰島素的2-8個突變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者側(cè)鏈和相對于 人胰島素的2-7個突變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者側(cè)鏈和相對于人胰 島素的2-6個突變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者側(cè)鏈和相對于人胰島素 的2-5個突變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者側(cè)鏈和相對于人胰島素的2-4 個突變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者側(cè)鏈和相對于人胰島素的2-3個突 變，其中至少兩個取代是針對半胱氨酸殘基，或者側(cè)鏈和相對于人胰島素的2個半胱氨酸 取代。
[0103] 通過說明取代天然的氨基酸殘基的氨基酸殘基的鏈（A或B)，位置和一個或三個 字母代碼來表示胰島素分子的修飾。
[0104] 在本文中，術(shù)語像"A1"、"A2"和"A3"等分別表明胰島素A鏈中的位置1、2和3(從 N末端計算）的氨基酸。類似地，術(shù)語像B1、B2、B3等分別表明胰島素B鏈中的位置1、2和 3(從N末端計算）的氨基酸。使用氨基酸的一個字母代碼，術(shù)語像A10C表示在A10位的氨 基酸是半胱氨酸。使用氨基酸的三個字母代碼，相應(yīng)的表達(dá)是AlOCys。
[0105] " desB30 "，"B (1-29) " 或 " desThrB30 " 是指缺乏 B30 (蘇氨酸，Thr)氨基酸的天然 胰島素B鏈或其類似物，"A(l-21)"是指天然的胰島素A鏈。因此，例如，A10C，BlC，desB30 人胰島素或者AlOCys，BICys，desB30人胰島素（或者CysAlO, CysBl，desThrB30人胰島 素）是人胰島素的類似物，其中用半胱氨酸取代A鏈的10位的氨基酸被，用半胱氨酸取代 B鏈的1位的氨基酸，B鏈的30位的氨基酸（蘇氨酸，Thr)缺失。
[0106] 本文中，根據(jù)以下原則進(jìn)行肽或蛋白的命名：根據(jù)相對母體肽或蛋白如人胰島素 的突變和修飾（如?；┙o予名稱。對于?；糠值拿?，根據(jù)IUPAC命名法進(jìn)行命名，其 它情況下根據(jù)肽命名法命名。例如，命名?；糠郑?br>【主權(quán)項】
1. 胰島素衍生物，具有兩個或更多個半胱氨酸取代和連接于胰島素的側(cè)鏈，其中所述 側(cè)鏈?zhǔn)峭ㄊ剑篈cy-AAln-AA2m-AA3p-的?；糠?，其中n為O或1-3范圍內(nèi)的整數(shù)；m為O或 1-10范圍內(nèi)的整數(shù)；P為O或1-10范圍內(nèi)的整數(shù)；Acy為包含約8個-約24個碳原子的脂 肪酸或脂肪二酸；AAl為中性線型或環(huán)狀氨基酸殘基;AA2為酸性氨基酸殘基;AA3為中性 的、含亞烷基二醇的氨基酸殘基；所述式中AA1、AA2和AA3出現(xiàn)的順序可獨立地相互交換， 其中保留了三個二硫鍵和與人胰島素相關(guān)的期望的生物活性，并且與人胰島素相關(guān)的期望 的生物活性選自結(jié)合胰島素受體，結(jié)合IGF-I(胰島素生長因子1)受體，體外效力和體內(nèi)效 力，并且 其中所述半胱氨酸被取代至修飾的胰島素的兩個位置中，其中所述位置選自： A10C,BlC； A10C, B2C； A10C, B3C； A10C, B4C； A10C，B5C;和B1C，B4C。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中半胱氨酸被取代至胰島素類似物的兩個位置 中，其中所述位置選自： A10C,BlC； A10C, B2C； A10C, B3C； A10C，B4C;和B1C，B4C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中半胱氨酸被取代至胰島素類似物的兩個位置 中，其中所述位置選自： A10C,BlC； A10C, B2C； A10C，B3C;和A10C，B4C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項的胰島素衍生物，其中所述半胱氨酸被取代至修飾的 胰島素的兩個位置中，其中所述位置選自： A10C，B3C;和A10C，B4C。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的胰島素衍生物，其中所述半胱氨酸被取代至修飾的胰 島素的兩個位置中，其中所述位置為AlOC和B3C。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的胰島素衍生物，其中所述半胱氨酸被取代至修飾的胰 島素的兩個位置中，其中所述位置為AlOC和B4C。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的胰島素衍生物，其中用半胱氨酸取代選自A-鏈的A9、 AKKAll和A12的位置中的至少一個氨基酸殘基，用半胱氨酸取代選自B-鏈的B1、B2、B3、 B4、B5和B6的位置中的至少一個氨基酸殘基，以及任選地缺失B30位的氨基酸。
8. 前述權(quán)利要求中任一項的胰島素衍生物，其中用半胱氨酸取代A-鏈的AlO位的氨基 酸殘基，用半胱氨酸取代選自B-鏈的BI、B2、B3和M的位置中的氨基酸殘基，以及任選地 缺失B30位的氨基酸。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的胰島素衍生物，其中用半胱氨酸取代A-鏈的AlO位的 氨基酸殘基，用半胱氨酸取代選自B-鏈的B3和M的位置中的氨基酸殘基，以及任選地缺 失B30位的氨基酸。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的胰島素衍生物，其中用半胱氨酸取代A-鏈的AlO位 的氨基酸殘基，用半胱氨酸取代B-鏈的B3位的氨基酸，以及任選地缺失B30位的氨基酸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含額外的二硫鍵的胰島素衍生物及其制備方法。
【IPC分類】C07K14-62
【公開號】CN104693302
【申請?zhí)枴緾N201510007033
【發(fā)明人】P.馬德森, F.胡巴萊克, T.B.克杰爾德森, S.盧德維格森
【申請人】諾沃—諾迪斯克有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2011年6月21日
【公告號】CA2802510A1, CN102985440A, EP2585485A1, US8853155, US20130157938, US20140371140, WO2011161125A1