(2)菌懸液的制備方法:離屯、收集培養(yǎng)好的菌體，無菌生理鹽水洗涂2-3次后，再用 無菌生理鹽水適量稀釋制成ODsgg值在0.6-0.8的菌懸液，取lOiiL菌懸液涂在載片上待處理。
[0040] (3)ARTP誘變:ARTP處理參數(shù)為:載片處于氣流端口 2mm處；功率為120W;氣流量為 10SLM;作用時間為25s。
[0041 ] 3.結構類似物抗性突變株的篩選
[0042] 將經(jīng)過ARTP誘變處理后的菌懸液涂布在含有一定濃度結構類似物的基本培養(yǎng)基 平板上，37Γ培養(yǎng)2地后，菌落較大的菌株為可能的目標突變菌株。
[0043] 4.高通量篩選喀晚核巧高產(chǎn)菌
[0044] 從結構類似物抗性平板上挑取大菌落點接到已做好標記的LB平板上，并轉接入已 滅菌并盛有400微升無菌LB培養(yǎng)基的深孔中，LB平板37Γ過夜培養(yǎng)后，4Γ保藏，作為進一步 的篩選用。平板36°C，200rpm，培養(yǎng)lOh后，W10%的接種量，一一轉接種到盛有400微升孔板 發(fā)酵培養(yǎng)基的無菌新孔板中，36°C3200rmp，培養(yǎng)30h。培養(yǎng)結束后，離屯、發(fā)酵樣品，將上清稀 釋100倍后，分別取200微升到酶標板中，用酶標儀檢測樣品在270nm下的吸光值OD270 ,將 OD270較高菌株進行保藏，進行進一步的搖瓶復篩。圖1為微孔板篩選結果.
[0045] 5.搖瓶復篩
[0046] (1)培養(yǎng)基：
[0047] 活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1，蛋白腺10,牛肉膏10,酵母粉5,化C1 2.5,瓊脂 20，pH 6.7~7.0,0.1MPa，20min。
[004引種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,酵母粉5,蛋白腺10,硝酸鋼15,憐酸二氨鐘1，憐酸氨 二鐘5.2，硫酸儀1，巧樣酸鋼 1，pH 6.7~7.0，0.075MPa，15min。
[0049] 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100,酵母粉5,蛋白腺10,硝酸鋼15,憐酸二氨鐘1，憐酸 氨二鐘5.2，硫酸儀1，巧樣酸鋼1，抑6.7~7.0，0.075MPa，15min。葡萄糖分消。
[0050] (2)培養(yǎng)方法：
[0051] 斜面培養(yǎng):取-80°C保藏菌種劃線接種于活化斜面，37°C培養(yǎng)12h，并傳代一次。
[0052] 種子培養(yǎng)：用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面種子接種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的500mLS角 瓶中，九層紗布封口，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)化。
[0053] 發(fā)酵培養(yǎng):吸取3mL種子液接種于裝有27mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL擋板Ξ角瓶中，九 層紗布封口，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)30h。
[0054] (3)分析方法：
[0055] 抑測定:采用抑6.4-8.0精密抑試紙測定。
[0056] 生物量測定:發(fā)酵過程中，將發(fā)酵液適當稀釋后用分光光度計測定600nm處的吸光 度值0D600，來表征菌體生長情況。
[0化7] 殘?zhí)菧y定:室溫下將發(fā)酵液于130(K)r/min離屯、2min，取上清液10化加入至99化L去 離子水中充分混勻，然后取SSiiL采用SBA-40E系列生物傳感分析儀測定其殘?zhí)橇浚鶞y值即 為發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，單位為g/L。
[005引喀晚核巧濃度測定：取離屯、后的發(fā)酵液上清液10化L加入到90化L去離子水中，W Ig/L標準樣品為參比并作相同的稀釋處理，全部樣品經(jīng)過0.45皿濾膜過濾后采用HPLC測定 發(fā)酵液中喀晚核巧產(chǎn)量。采用的色譜柱為化61101116116義661111111511(：18 11(^150*4.6臟，柱 溫30 °C，流動相為乙臘:水=2:98，流速ImL/min，每個樣品進樣1化L，分析時間12min。
[0059] 圖2為搖瓶篩選的結果。
[0060] 6.化發(fā)酵罐的發(fā)酵驗證.
[0061] 實施例2突變株A219發(fā)酵生產(chǎn)尿巧喀晚
[0062] (1)本實施例所用培養(yǎng)基：
[0063] 活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1，蛋白腺10,牛肉膏10,酵母粉5,化C1 2.5,瓊脂 20，pH 6.7~7.0,0.1MPa，20min。
[0064] 種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,酵母粉5,蛋白腺10,硝酸鋼15,憐酸二氨鐘1，憐酸氨 二鐘5.2，硫酸儀1，巧樣酸鋼1，抑6.7~7.0,0.0751?日，15111111。葡萄糖單獨滅菌。
[0065] 化發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50,酵母粉5,玉米漿20,硝酸鋼15,憐酸二氨鐘 1，憐酸氨二鐘5.2,硫酸儀5,硫酸錠5,巧樣酸鋼10,谷氨酸鋼10,氯化巧1，硫酸儘0.02,硫酸 鋒0.02，pH 6.7~7.0，玉米漿單獨滅菌，巧鹽單獨滅菌，儀儘鋒鹽配成混合溶液一起滅菌， 葡萄糖配成80 %溶液單獨滅菌，其余組分一起滅菌，滅菌條件玉米漿為0.1 MPa，20min，其余 為0.075MPa，15min。
[0066] (2)培養(yǎng)方法：
[0067] 斜面培養(yǎng):取-80°C保藏菌種劃線接種于活化斜面，37°C培養(yǎng)12h，并傳代一次。
[0068] 種子培養(yǎng)：用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面種子接種于裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的1LS角瓶 中，九層紗布封口，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)化。
[0069] 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵罐定容化，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為36°C，pH 7.0,溶氧控制在 20-30%左右，殘?zhí)强刂圃? %左右，發(fā)酵周期為4她。
[0070] (3)分析方法：
[0071] 抑測定:采用抑6.4-8.0精密抑試紙和發(fā)酵罐抑電極測定。
[0072] 生物量測定:發(fā)酵過程中，將發(fā)酵液適當稀釋后用分光光度計測定600nm處的吸光 度值0D600，來表征菌體生長情況。
[0073] 殘?zhí)菧y定:室溫下將發(fā)酵液于130(K)r/min離屯、2min，取上清液10化加入至99化L去 離子水中充分混勻，然后取SSiiL采用SBA-40E系列生物傳感分析儀測定其殘?zhí)橇浚鶞y值即 為發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，單位為g/L。
[0074] 喀晚核巧產(chǎn)量測定：取離屯、后的發(fā)酵液上清液10化L加入到90化L去離子水中，W Ig/L標準樣品為參比并作相同的稀釋處理，全部樣品經(jīng)過0.45皿濾膜過濾后采用HPLC測定 發(fā)酵液中喀晚核巧產(chǎn)量。采用的色譜柱為化enomenexGemini5uC18110A150*4.6mm，柱 溫30 °C，流動相為乙臘:水=2:98，流速ImL/min，每個樣品進樣1化L，分析時間12min。
[0075] (4)發(fā)酵結果：
[0076] 圖1為A219在發(fā)酵過程中菌體的生長狀況與出發(fā)菌株TD131的對比圖，圖2為A219 在發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗與出發(fā)菌株TD131的對比圖，從對比結果來看兩株菌的生長和 耗糖情況并沒有太大差異。圖3為A219在發(fā)酵過程中尿巧的積累量與出發(fā)菌株TD131的對比 圖，從對比結果來看，發(fā)酵48小時，A219的尿巧產(chǎn)量為13.5g/L3是出發(fā)菌株TD131尿巧產(chǎn)量 (4.1邑/1)的3.3倍。
[0077] 實施例3突變株A219對不同結構類似物的耐受性檢測
[007引（1)檢測方法:從保菌管中取10微升菌液接LB搖管，37°C，200rpm，培養(yǎng)10-12小時， 離屯、收集培養(yǎng)好的菌體，無菌生理鹽水洗涂2-3次后，在用無菌生理鹽水梯度稀釋十萬倍， 然后取100微升菌液分別涂布于含有不同濃度結構類似物基本培養(yǎng)基平板上，每個濃度Ξ 個平行，對照為基本培養(yǎng)基平板(不含結構類似物）d37°C培養(yǎng)24h后，對平板所長菌落數(shù)進 行統(tǒng)計，菌落數(shù)的多少反映耐受性的高低。一定時間內(nèi)能夠在高濃度抗性平板上長出大量 菌落說明此菌株對該結構類似物的耐受能力強。
[00巧]基本培養(yǎng)基（g/L):硫酸錠3,憐酸氨二鐘1，水解酪素3，VBl、VB3、VB5、VBl3、VH各 0.1mg，MgS〇4 · 7此0 0.1，ZnS〇4 · 7出0、MnS〇4 · 7出0各2mg，色氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮 氨酸各0.1 g，葡萄糖10，瓊脂20，其中葡萄糖配制成800g/L的溶液，0.075MPa，15min滅菌，其 余0.1 MPa，20min滅菌。
[0080] (2)檢測結果：
[0081] 表1:兩株菌對不同喀晚核巧結構類似物的耐受性檢測結果
[0082]
[0083]從檢測結果來看A219與出發(fā)菌株TD131相比，對2-硫尿喀晚的耐受能力分別提高 了大約20倍;對6-氮雜尿喀晚的耐受性提高了大約35倍;對5-氣尿喀晚的耐受能力提高了 大約125倍。
【主權項】
1. 一種氨甲酰磷酸合成酶大亞基突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如序 列表SEQ ID No.4所示。2. 權利要求1所述突變體的編碼基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。3. -株枯草芽孢桿菌突變株，其特征在于，包含權利要求1所述的突變體，具體為枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A219,保藏編號為CGMCC No. 11774。4. 權利要求3所述突變株發(fā)酵生產(chǎn)嘧啶核苷的方法，其特征在于，具體為：接種量為 10 %，培養(yǎng)溫度為34-36 °C，pH 6.7-7.0，溶氧控制在20-30 %，殘?zhí)强刂圃?.5-1 %，發(fā)酵周 期48h，發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中尿苷濃度可達13.5 ± 1 g/L; 發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計:葡萄糖50,酵母粉5,玉米漿20,硝酸鈉15,磷酸二氫鉀1，磷酸 氫二鉀5.2，硫酸鎂5，硫酸銨5，檸檬酸鈉10，谷氨酸鈉10，氯化鈣1，硫酸錳0.02，硫酸鋅 0.02，pH 6.7~7.0，玉米漿單獨滅菌，鈣鹽單獨滅菌，鎂錳鋅鹽配成混合溶液一起滅菌，葡 萄糖配成80 %溶液單獨滅菌，其余組分一起滅菌，滅菌條件玉米漿為0.1 MPa，20min，其余為 0.075MPa，15min。
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶工程技術領域，具體涉及一株高產(chǎn)嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶調節(jié)位點。本發(fā)明提供了一株生產(chǎn)嘧啶核苷的枯草芽孢桿菌突變株和一個氨甲酰磷酸合成酶的編碼基因，明確了一個與氨甲酰磷酸合成酶受終產(chǎn)物反饋抑制相關的關鍵調控位點，可以為以后嘧啶核苷高產(chǎn)菌株的選育提供參考。所提供的枯草芽孢桿菌突變株，通過發(fā)酵法生產(chǎn)核苷嘧啶尿苷產(chǎn)量可達13.5±1g/L，并且對不同嘧啶核苷結構類似物的耐受性顯著提高。CGMCC No.1177420151202
【IPC分類】C12R1/125, C12N15/52, C12P19/38, C12N9/00, C12N1/20
【公開號】CN105671008
【申請?zhí)枴緾N201511035141
【發(fā)明人】謝希賢, 陳寧, 吳鶴云, 徐慶陽, 張成林, 范曉光, 袁輝
【申請人】天津科技大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年12月31日