基于模擬人組胺受體4（hr4）表位的疫苗及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于模擬人組胺受體4(HR4)表位 的疫苗及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] HR4分子及其詰抗劑的相關(guān)研究：1. HR4分子組胺受體-4 (histamine receptor-4, HR4)是一種新發(fā)現(xiàn)的組胺受體，為跨膜G蛋白親連受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs)，功能在于抑制腺苷酰環(huán)化酶活性，活化磷酸蛋白酶C(phospholipase C)和誘導(dǎo)鈣離子流動。HR4優(yōu)先分布于免疫器官和造血細(xì)胞上，涉及到變應(yīng)性鼻炎 (allergic rhinitis，AR)的病理性免疫應(yīng)答的所有免疫細(xì)胞。肥大細(xì)胞、CD4+T、CD8+T細(xì) 胞、嗜酸性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞都可以檢測到HR4的表達(dá)，并被證明具有 介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)功能。2. HR4拮抗劑HR4拮抗劑對TLR配體誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的活化過程產(chǎn)生的 IL-6、KC、MIP-α和IP-10等細(xì)胞因子和趨化因子表現(xiàn)為抑制作用，HR4的拮抗劑、負(fù)性激 動劑已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中獲得了很好的抗炎前景。體外研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)HR4信號途徑無作用的 時候，在抗原刺激過程時，IFN-γ和特異性IgG2a均不增加，而且炎性細(xì)胞因子IL-6和 IL-17A也都表現(xiàn)為被抑制。這說明針對HR4信號途徑的治療在抑制Th2細(xì)胞應(yīng)答時，機(jī)體 內(nèi)的微環(huán)境并不向Thl類過度反應(yīng)偏離，體內(nèi)微環(huán)境處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。JNJ-7777120是 第一個，有效的，選擇性非咪唑histamine H4receptor詰抗劑，Ki為4. 5nM，比作用于其他 組胺受體選擇性高1000倍以上，其作用表現(xiàn)在嗜酸性粒細(xì)胞的趨化，肥大細(xì)胞的趨化以及 變應(yīng)性鼻炎及變應(yīng)性氣道炎癥，并在變應(yīng)性鼻炎皮炎動物模型獲得良好的治療作用。JNJ 7777120具有口服生物利用度，處理大鼠為30%，處理犬為100%，處理這兩個品種的半衰 期都為3小時。JNJ 7777120處理小鼠骨髓衍生的肥大細(xì)胞，抑制組胺誘導(dǎo)的趨化性和鈣 流入。JNJ 7777120處理小鼠，抑制組胺誘導(dǎo)的氣管肥大細(xì)胞從結(jié)締組織向上皮細(xì)胞的迀 移。JNJ-7777120為化學(xué)合成，價格昂貴，3030RMB/50mg，存在口服生物利用度，對肝腎影響 尚未明確。
[0003] 菌體展示技術(shù)（Phage Display Technology)是一項(xiàng)特異性多肽或蛋白的篩選 技術(shù)，1985年由美國Missouri大學(xué)G. P. Smith等首創(chuàng)，此技術(shù)可將目的基因編碼的多肽以 融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和 生物活性，使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子（如抗 體、酶和細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過體外親和淘選程序得以快速鑒定。噬菌體展示 技術(shù)已被廣泛用于腫瘤診斷標(biāo)志物和抗腫瘤先導(dǎo)化合物的篩選、腫瘤特異性抗體和腫瘤藥 物靶向運(yùn)輸?shù)确矫娴难芯俊?br>[0004] 噬菌體展示技術(shù)正逐步發(fā)展成熟，為獲取對癌癥診斷和治療有價值的多肽或抗體 提供了重要手段。目前已發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤相關(guān)的基因和抗原，腫瘤相關(guān)配體和多肽的篩選 已成為尋找抗腫瘤藥物的新熱點(diǎn)，針對腫瘤細(xì)胞不同表達(dá)分子的特異性結(jié)合多肽，為腫瘤 治療提供了新的靶點(diǎn)，也為放射標(biāo)記的腫瘤檢測、化療藥物的給藥、藥物敏感實(shí)驗(yàn)及腫瘤的 免疫治療提供了新的分子靶位，噬菌體多肽還具有抑制腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、阻礙腫瘤新生 血管生成和轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，將多肽與脂質(zhì)體或納米藥物偶聯(lián)，既有助于 在達(dá)到更好的靶向治療效果，又減小了藥物的毒副作用，還可用于腫瘤血管三維成像和分 子影像技術(shù)的檢測及腫瘤治療療效評價。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] (一）解決的技術(shù)問題
[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選HR4表位模擬 肽及其篩選方法，本發(fā)明利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫技術(shù)篩選HR4表位模擬肽的多肽序列， ELISA鑒定噬菌體單克隆對HR4單抗的親和力，獲得30個噬菌體克隆，測序獲得一條多肽序 列，篩選獲得的人HR4單克隆抗體特異性多肽，進(jìn)而構(gòu)建HR4表位模擬肽疫苗。
[0007] (二）技術(shù)方案
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選HR4表位模擬肽，利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選得 到一條多肽片段，其氨基酸序列為：TFKFTLSYRQVH。
[0010] 噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選HR4表位模擬肽的篩選方法，包括以下步驟：
[0011] SI、HR4單克隆抗體IgG純化，用pH值為6. 8~7. 1的20mmol/L磷酸緩沖液稀釋 HR4單克隆抗體，并包被ELISA板；
[0012] S2、用封閉緩沖液室溫封閉，用TBS和Tween20的混合液進(jìn)行洗滌；
[0013] S3、向包被有單克隆抗體的微孔中加入篩選用噬菌體，緩慢振搖，使噬菌體與包被 抗體充分接觸，用TBS和Tween20的混合液洗滌去除未結(jié)合的噬菌體；
[0014] S4、用甘氨酸-鹽酸緩沖液室溫洗脫結(jié)合的噬菌體，中和液中和后在宿主菌大腸 桿菌ER2738中擴(kuò)增噬菌體，作為下一輪篩選的投入物，同時測定洗脫物和投入物的滴度；
[0015] S5、重復(fù)上述步驟共進(jìn)行三輪篩選，從第三輪篩選后的洗脫物滴定平板中隨機(jī)挑 選30個噬菌體克隆，進(jìn)行噬菌體ELISA、噬菌體微篩選，得到本發(fā)明物。
[0016] 優(yōu)選的，步驟Sl中所述磷酸緩沖液pH為6. 9~7. 0。
[0017] 優(yōu)選的，步驟S4所述甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液pH為2. 6~2. 8。
[0018] HR4表位模擬肽疫苗的構(gòu)建方法，包括以下步驟：Sl、HR4的模擬表位PT2 的人工合成，按照上述的多肽表位氨基酸序列結(jié)果，采用固相合成法合成多肽表位 PT2 (TFKFTLSYRQVH)合成由輝源生物科技（上海）有限公司，純度為98%以上，同時合成對 照多肽；
[0019] S2、PT2與HR4單抗特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以2mg/L PT2和對照多肽包被96孔酶聯(lián)板， 每孔100 μ I，4°C孵育過夜，傾去包被液，于每孔中加入封閉液，4°C封閉2h，傾去封閉液， TBST洗6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體，將人HR4單克 隆抗體，人CEA單克隆抗體分別加入對應(yīng)的孔中，室溫反應(yīng)lh，TBST洗6次，各孔分別加入 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG，室溫孵育lh。TBST洗3次，Imin/次，用TMB顯 色，HCl終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)；
[0020] 33、構(gòu)建？了2-〇^_脂質(zhì)體復(fù)合物，以0.9%無菌氯化鈉溶液溶解多肽和〇^，然后 加入相同體積的脂質(zhì)體Lipofect，使每200 μ 1含多肽100 μ g，含CTB 5 μ g，4°C靜置過夜， 次日晨取出，升至室溫（25°C )，即可。
[0021 ] 優(yōu)選的，所述HR4表位模擬肽疫苗用于治療應(yīng)變性的過敏性疾病。
[0022] (三）有益效果
[0023] 本發(fā)明利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫技術(shù)篩選HR4表位模擬肽的多肽序列，ELISA鑒 定噬菌體單克隆對HR4單抗的親和力，獲得30個噬菌體克隆，測序獲得一條多肽序列，命名 為PT2,進(jìn)一步鑒定噬菌體陽性克隆的靶向性結(jié)果提示噬菌體陽性克隆能夠特異性結(jié)合人 HR4單克隆抗體，而不與人CEA單抗和BSA結(jié)合，篩選獲得的人HR4單克隆抗體特異性多肽， 進(jìn)而構(gòu)建HR4表位模擬肽疫苗，本發(fā)明HR4模擬表位為基礎(chǔ)的疫苗，將會在臨床的變應(yīng)性鼻 炎治療，及HR4拮抗劑的研制方面打下良好的基礎(chǔ)，為其構(gòu)建工作提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說明】
[0024] 圖1、隨機(jī)十二肽p III融合蛋白的N末端序列；
[0025] 圖2、噬菌體12肽庫與HR4單克隆抗體各輪篩選產(chǎn)物滴度，其中A :第一輪稀釋102 倍測滴度約I. 2x 104pfu ;B :第二輪稀釋103倍測滴度，約2. 7x 105pfu ;C :第三輪稀釋104 倍測滴度，約3. 9x 106pfu。
[0026] 圖3、Elisa檢測第三輪篩選噬菌體克隆與HR4單克隆抗體的親和力：橫坐標(biāo)1，2， 3，…，30分別代表菌體克隆phage-1, phage-2, phage-3,…，phage-30。Con代表隨機(jī)對 照克隆。
[0027] 圖4、Elisa檢測噬菌體克隆與HR4單克隆抗體的親和力。
[0028] 圖5、陽性噬菌體克隆與HR4單抗特異性結(jié)合的分析圖。
[0029] 圖6、ELISA檢測血清與HR4的結(jié)合結(jié)果分析圖。
[0030] 圖7、ELISA檢測血清中IFN-r，IL-2, IL-6表達(dá)水平結(jié)果分析圖。
[0031] 圖8、Real-time PCR檢測血細(xì)胞中IFN-r，IL-2, IL-6表達(dá)水平結(jié)果分析圖。
[0032] 圖9、ELISA檢測支氣管灌洗液與HR4的結(jié)合結(jié)果分析圖。
[0033] 圖10、Real-time PCR檢測黏膜組織中IFN-r，IL-2, IL-6表達(dá)水平結(jié)果分析圖。
[0034] 圖11、Western-blotting檢測黏膜組織中IFN-r, IL-2，IL-6表達(dá)水平結(jié)果分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例， 對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部 分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作 出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0036] 一、主要實(shí)驗(yàn)材料
[0037] ⑴革巴分子：Anti_HR4antibody (abl78704)單克隆抗體前期進(jìn)行了 ProteinA/G純 化，得到高純度的（>95% )可用于噬菌體肽庫篩選的單克隆抗體。
[0038] ⑵菌體肽庫：卩策菌體隨機(jī)十二肽庫（Ph. D-12TM ph