本發(fā)明涉及分子生物學，具體地說，涉及一種水稻抗稻瘟病重組核酸片段。

背景技術：

長期以來，傳統(tǒng)育種的選擇方法主要依賴于田間表現(xiàn)型的評價，根據(jù)育種家個人經驗進行取舍，其最大的缺點在于耗時長，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應是能夠直接對基因型進行選擇。隨著分子生物技術的發(fā)展，分子標記為實現(xiàn)對基因型的直接選擇提供了可能。近年來，已開始應用分子標記輔助選擇方法來改良個別目標性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產量損失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對稻瘟病研究的逐步深入，許多水稻抗稻瘟病基因dna片段相繼被定位和克隆。其中，pi1及pik簇等位基因定位于水稻第11染色體長臂近末端區(qū)域(hua等，theoreticalandappliedgenetics.2012,125:1047-1055；li等，molecularbreeding.2007,20:179-188；alok等，functional&integrativegenomics.2012,12:215-228；yuan等，theoreticalandappliedgenetics.2011,122:1017-1028)。

為了提高育種的穩(wěn)定性、縮短育種過程和時間、有效利用水稻抗性資源，有必要對水稻在雜交育種中產生的稻瘟病抗性基因重組片段進行研究，為能夠高效穩(wěn)定的實現(xiàn)水稻抗性育種提供有效手段。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗稻瘟病重組核酸片段reccr010007及其檢測引物與應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供一種重組核酸片段，其特征在于，其核苷酸序列包含seqidno.1所示165-312bp的序列或其片段、或其變體、或其互補序列。

作為優(yōu)選，其核苷酸序列包含seqidno.1所示的序列或其片段、或其變體、或其互補序列。seqidno.1所示的序列來自于‘深95b’和‘華3418b’基因組區(qū)域交換產生的重組植株。

一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補序列。這樣的變體序列包括一個或多個核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導致相應的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領域內已知的序列比對程序包括雜交技術確定序列同一性。實施方案的核苷酸序列變體與本發(fā)明的序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4、3、2或甚至1個核苷酸。

第二方面，本發(fā)明提供了用于擴增所述重組核酸片段的引物。

所述引物包括本領域技術人員針對該擴增目標可設計得到的所有引物。

當擴增目標為seqidno.1所示序列時，所述引物可選自：

(i)特異性識別seqidno.1所示序列1-165bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識別seqidno.1所示序列312-393bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(ii)以下第一組引物對與第二組引物對的組合，其包含：

(a)第一組引物對：特異性識別seqidno.1所示序列第1-165bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識別seqidno.1所示序列第166-311bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(b)第二組引物對：特異性識別seqidno.1所示序列第166-311bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識別seqidno.1所示序列第312-393bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(iii)特異性識別包含seqidno.1所示序列第165位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含seqidno.1所示序列第312位核苷酸的序列的反向引物；

(iv)特異性識別包含seqidno.1所示序列第165位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別seqidno.1所示序列第312-393bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(v)特異性識別seqidno.1所示序列第1-165bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識別包含seqidno.1所示序列第312位核苷酸的序列的反向引物。

具體而言，本發(fā)明提供擴增及檢測seqidno:1所示序列的引物組合如下：

擴增引物包括：

正向引物：5’-cacaagaccctcgcccttgacg-3’，

反向引物：5’-aagctcacgcttaccgtgctcc-3’，

測序引物包括：

正向引物：5’-ggtcctccgtgccgatacgt-3’，

反向引物1：5’-aacaggtgggaggctgcc-3’，

反向引物2：5’-aagctcacgcttaccgtgctcc-3’。

進一步地，本發(fā)明還提供含有前述引物的試劑盒。

第三方面，本發(fā)明提供了所述重組核酸片段在抗稻瘟病水稻育種中的應用。

例如，將該片段導入其他水稻植株中，以得到具有抗稻瘟病的水稻植株。

第四方面，本發(fā)明提供了篩選含有所述重組核酸片段的水稻植株 的方法。

根據(jù)如前所述的重組核酸片段設計特異性引物，以待測基因組為模板進行pcr反應，并分析pcr擴增產物的步驟。具體而言，所述引物如前所述?？蛇x擇地，利用sanger測序法分析pcr擴增產物。

所述方法以待測樣品基因組dna為模板，利用上述擴增引物進行pcr擴增，然后利用上述測序引物對獲得的擴增產物進行測序，若測序結果與seqidno.1序列一致或互補，則待測樣品中含有seqidno.1所示同源重組片段。

通過檢測確定了待測樣品中含有seqidno.1所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

作為優(yōu)選，可利用前述引物或前述試劑盒，檢測待測樣品基因組中是否含有權利要求1所述的重組核酸片段。

可以理解的是，通過所述方法篩選得到的含有本發(fā)明公開的重組核酸片段的水稻植株或其種子也屬于本發(fā)明的保護范圍。

第五方面，本發(fā)明提供了含有所述重組核酸片段的水稻植株的選育方法，具體為：以‘深95b’為輪回親本，‘華3418b’為供體親本進行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘深95b’進行回交，再將所得到的回交種進行自交，獲得含有權利要求1所述重組核酸片段的水稻植株；

其中，所述雜交種、回交種和自交種需分別利用分子標記和水稻全基因組育種芯片進行前景選擇和背景選擇。

所述分子標記為pic11id115a、pic11s122和pic11s166中的一種或多種。

具體而言，所述選育方法包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本進行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標記pic11id115a和負向選擇標記pic11s122、pic11s166對其進行抗稻瘟病基因組片段的單側同源重組片段篩選， 并利用水稻全基因組育種芯片，例如rice6k，對其進行背景選擇；2)選擇背景回復較好的重組單株(此世代背景回復值超過75％)與輪回親本再次進行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標記pic11id115a對其進行檢測，選擇含有抗稻瘟病基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如rice6k，對其進行背景選擇；3)選擇背景回復好的重組單株(此世代背景回復值超過87.5％)與輪回親本又一次進行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標記pic11id115a和負向標記pic11s122、pic11s166對其進行抗稻瘟病基因組片段的另一側同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如rice60k，對其進行背景選擇；以及4)選擇導入片段小，且背景回復好的重組單株(背景回復值超過93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標記pic11id115a對其進行檢測，并利用水稻全基因組育種芯片，例如rice60k，對其進行背景選擇，最終獲得含抗稻瘟病基因組重組核酸片段純合且背景回復(背景回復值超過99％)的水稻植株。

其中，利用分子標記進行前景選擇時采用的擴增引物如下：

擴增分子標記pic11id115a的引物對，其包括：

正向引物：5’-ctcagtgcccttttcttcctca-3’，

反向引物：5’-tcacagcaaagaccatacaaccat-3’；

擴增分子標記pic11s122的引物對，其包括：

正向引物：5’-tacgaccgtgacatgtcctt-3’，

反向引物：5’-attaaccaccatgctcacca-3’；

擴增分子標記pic11s166的引物對，其包括：

正向引物：5’-ttagcccctctctctctcca-3’，

反向引物：5’-gccagatctagcagaggtga-3’。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過全基因組選擇育種技術選育得到并提供了一種稻 瘟病抗性基因的重組核酸片段，本發(fā)明提供的重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關，可作為抗性資源應用于其他品種的培育。

本發(fā)明提供一種基于全基因組選擇育種技術選育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，該方法具有快速、準確、穩(wěn)定的優(yōu)勢，僅通過五世代轉育，即可僅將目標基因組片段導入受體材料，并同時實現(xiàn)背景的回復。

在上述基礎上，本發(fā)明通過以‘深95b’為輪回親本，‘華3418b’為供體親本進行雜交、回交與自交得具有稻瘟病抗性的重組植株，并得到了一種具有稻瘟病抗性的重組核酸片段。

本發(fā)明改良的受體材料為‘深95b’，是廣泛使用的不育系‘深95a’配套使用的保持系。利用上述方法，可以在保留‘深95b’原有優(yōu)點的情況下，導入稻瘟病抗性基因組片段，提高其稻瘟病抗性。進一步的，通過至少一代雜交、一代回交即可獲得穩(wěn)定的含有稻瘟病抗性片段的‘深95a’，再通過配組實現(xiàn)雜交種稻瘟病抗性的大幅度提高。本發(fā)明提供的基因組重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關，可作為抗性資源應用于其他品種的培育。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中cr010007水稻rice60k全基因組育種芯片檢測結果；其中，橫坐標數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘深95b’基因型，黑色線條代表供體親本‘華3418b’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無多態(tài)性區(qū)段。圖中第11號染色體黑色線條顯示區(qū)段即為導入的抗稻瘟病基因組重組核酸片段reccr010007。

圖2為本發(fā)明實施例2中reccr010007下游同源重組片段測序比對結果；圖中所示星號代表比對結果中相同堿基，圖中cr010007為獲得的新品系，t001為受體親本‘深95b’，r002為供體親本‘華 3418b’。

圖3為本發(fā)明實施例2中reccr010007下游同源重組片段的結構圖；其中，上方堿基為供體‘華3418b’的snp或indel標記，下方堿基為受體‘深95b’的snp或indel標記。灰色區(qū)段為來源于‘深95b’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來源于‘華3418b’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標為片段長度，以堿基對數(shù)目(bp)為單位。

圖4為本發(fā)明實施例3中cr010007稻瘟病抗性室內鑒定結果；圖中所示葉片依次為：(a)稻瘟病感病品種麗江新團黑谷；(b)原品種‘深95b’；(c)改良新品系cr010007；(d)稻瘟病抗病品種谷梅4號。

具體實施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本發(fā)明以及在本發(fā)明實踐中指導本領域普通技術人員。除非另作說明，術語按照相關領域普通技術人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書寫，包括具有天然核苷酸基本性質的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實施方案中，可以對本發(fā)明的核苷酸序列進行改變，以進行保守氨基酸替換。在某些實施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對本發(fā)明的核苷酸序列進行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。

具體地，本發(fā)明涉及對seqidno.1進一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細節(jié)描述于murray等(1989)nucleicacidsres.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高抗稻瘟病基因組重組核酸片段在水稻中的表達。

在一些實施方案中，本發(fā)明還涉及seqidno.1所示序列的 變體。一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補序列。這樣的變體序列包括一個或多個核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導致相應的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領域內已知的序列比對程序包括雜交技術確定序列同一性。實施方案的核苷酸序列變體與本發(fā)明的序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4、3、2或甚至1個核苷酸。

本發(fā)明還涉及包含seqidno.1所示序列中特定位點的序列或其片段或其變體或其互補序列，例如，包含seqidno.1所示序列的165-312位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列。根據(jù)包含上述特定位點的片段，能夠特異性地鑒定出相應的seqidno.1所示序列。進一步地，通過鑒定出含有seqidno.1所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細胞、植物器官、植物原生質體、植物可以從中再生的植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本發(fā)明的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說，可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好，預計有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本發(fā)明的實施方案中，采用水稻‘深95b’作為輪回親本，采用已被證實具有良好的稻瘟病抗性的水稻‘華3418b’作為供體。

在本發(fā)明所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標記對 重組植株進行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標記與目標基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準確率，一般同時用兩側相鄰的兩個標記對目標基因進行跟蹤選擇。

在本發(fā)明的實施方案中，采用的前景選擇標記包括正向選擇標記和負向選擇標記。在具體實施方案中，經優(yōu)化篩選使用的正向前景選擇標記是與目標基因組片段緊密連鎖的標記pic11id115a，負向選擇標記是位于目標片段上游的標記pic11s122，以及位于目標片段下游的標記pic11s166。

在本發(fā)明的實施方案中，利用上述前景選擇標記進行同源重組的檢測時，一側或單側同源重組的判斷標準是pic11id115a檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122或pic11s166檢出與‘深95b’相同帶型；兩側或雙側同源重組的判斷標準是pic11id115a檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122和pic11s166檢出與‘深95b’相同帶型。

在本發(fā)明中，可以使用任何一種可利用的芯片進行本發(fā)明所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實施方案中，可以采用本發(fā)明人在中國專利申請cn102747138a中公開的水稻全基因組育種芯片rice6k，或者在pct國際申請wo/2014/121419中公開的水稻全基因組育種芯片rice60k。這兩份申請文件中的全部內容整體并入本文作為參考。

以下實施例僅用于說明而非限制本發(fā)明范圍的目的。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本發(fā)明中所使用的水稻植株材料信息均可參見中國水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本發(fā)明中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組msu/tigr注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實施例1選育導入抗稻瘟病基因組片段的重組植株

本實施例中使用的材料為水稻‘深95b’及水稻‘華3418b’。

水稻‘華3418b’具有良好的稻瘟病抗性，并推測可能是第11號染色體的pi1及pik簇等位基因所在區(qū)域對該材料的稻瘟病抗性起到了關鍵作用。

在重組植株的選育過程中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇，對所采用的前景選擇分子標記進行了篩選。參照水稻日本晴基因組msu/tigr注釋第6.1版，下載第11染色體27,155,000至28,495,000dna序列。使用ssrlocator軟件對上述序列中的ssr位點進行掃描。利用primerpremier3.0軟件對尋找出的ssr位點設計引物，共設計引物385對。通過pcr的方法，篩選上述引物對在‘華3418b’及‘深95b’中的多態(tài)性，最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴增效率高的前景選擇分子標記，分別是正向選擇標記pic11id115a和負向選擇標記pic11s122、pic11s166。用于pcr擴增上述分子標記的具體引物信息見表1。

表1前景選擇分子標記引物信息

將水稻‘華3418b’中前述基因所在的基因組片段導入到水稻‘深95b’中，具體過程如下：

以‘深95b’為輪回親本，‘華3418b’為供體親本進行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘深95b’進行回交，獲得bc1f1種子，育苗后利用正向選擇標記pic11id115a和負向選擇標記pic11s122、pic11s166進行重組單株選擇，篩選出13個在目標基因組dna片段一側同源重組的單株，即pic11id115a檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122或pic11s166檢出與‘深95b’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片rice6k(cn102747138a) 對其進行背景選擇(yu等,plantbiotechnologyjournal.2014,12:28-37)。

在篩選出的13個單側同源重組單株中比較芯片結果，選擇背景回復最好的重組單株(此世代背景回復值超過75％)，使其與輪回親本‘深95b’再次進行回交，獲得bc2f1種子，育苗后利用正向選擇標記pic11id115a對其進行檢測，選擇含有目標基因組片段的重組單株，即pic11id115a檢出與‘華3418b’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片rice6k對其進行背景選擇。

選擇背景回復較好的單株(此世代背景回復值超過87.5％)，使其與輪回親本‘深95b’又一次進行回交，獲得bc3f1種子，育苗后利用正向選擇標記pic11id115a和負向標記pic11s122、pic11s166對收獲的種子進行目標基因組片段另一側同源重組片段的篩選，獲得7個在目標片段兩側重組的單株，即pic11id115a檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122和pic11s166檢出與‘深95b’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片rice60k(wo/2014/121419)對上述7個雙側交換單株進行背景和目標片段選擇(chen等，molecularplant.2014,7:541-553)，篩選到導入目標片段較小，且背景回復好的目標單株一個(此世代背景回復值超過93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得bc3f2，育苗后利用正向選擇標記pic11id115a對其進行檢測，選擇含有目標基因組片段的單株，即pic11id115a檢出與‘華3418b’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片rice60k對其進行背景選擇。

最終獲得目標片段純合，且背景回復(背景回復值超過99％)的株系一個，命名為cr010007。芯片檢測結果見圖1。

實施例2導入稻瘟病抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導入的稻瘟病抗性基因組片段大小，對‘深95b’導入片段的純合單株進行了目標基因組片段兩側同源重組片段的測序。將cr010007所含的抗稻瘟病基因組重組核酸片段命名為reccr010007。

通過水稻全基因組育種芯片rice60k檢測結果初步確定，reccr010007位于snp標記f1127982620tc上游。

同時，使用miseq測序技術對‘深95b’、‘華3418b’和cr010007三個樣本進行全基因組測序。使用truseqnanodnaltkit(illumina)試劑盒進行文庫建立，使用libraryquantificationkit–universal(kapabiosystems)試劑盒進行定量，使用miseqv2reagentkit(illumina)試劑盒進行測序反應。使用miseq臺式測序儀(illumina)進行檢測。具體步驟及方法參見各試劑盒及測序儀使用說明書。

根據(jù)前述snp芯片及miseq測序結果，將reccr010007下游同源重組片段定位在第11染色體的27961872bp到27963142bp區(qū)間。

在此基礎上，參照水稻日本晴基因組msu/tigr注釋第6.1版，下載對應區(qū)段dna序列。使用primerpremier5.0軟件設計擴增及測序引物，設計要求為引物長22nt左右、gc含量40-60％且沒有錯配。

以受體親本‘深95b’和供體親本‘華3418b’為對照，對reccr010007下游同源重組片段設計擴增引物，使用高保真酶kodfxneo(toyobo)進行擴增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴增條件，確保擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳檢測中顯示為單一明亮條帶。其中確定的下游同源重組片段擴增引物反應條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37個循環(huán)；20℃1min。由此，最終篩選出一對擴增引物用于下游同源重組片段的擴增。

另外，以擴增產物為模板，利用sanger測序法進行測序，根據(jù)實際測序效果，最終篩選出3條測序引物用于下游同源重組片段的測序。具體的擴增引物及測序引物序列見表2，測序結果見圖2。

reccr010007下游同源重組片段測序長度為393bp(seqidno:1)。1-165bp為供體‘華3418b’的基因組區(qū)段，與受體‘深 95b’比較，存在6個snp。166-311bp這一146bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。312-393bp為受體‘深95b’基因組片段，與供體‘華3418b’比較，存在4個snp。

圖3為reccr010007下游同源重組片段的結構圖。上方堿基為供體‘華3418b’的snp或indel標記，下方堿基為受體‘深95b’的snp或indel標記?；疑珔^(qū)段為來源于‘深95b’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來源于‘華3418b’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標為片段長度，以堿基對數(shù)目(bp)為單位。

表2抗稻瘟病基因組重組核酸片段擴增及測序引物信息

實施例3‘深95b’導入抗稻瘟病基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定抗性效果，對本發(fā)明選育的新品系cr010007、輪回親本‘深95b’、稻瘟病抗病品種谷梅4號(作為陽性對照)，以及稻瘟病感病品種麗江新團黑谷(作為陰性對照)進行室內種植，將其培養(yǎng)至3-4葉期后采用如下方法進行鑒定：

選取2013年恩施病圃稻瘟病病樣上分離的21k02-1和21k14-1、四川病圃的6102-1、福建病圃的8111-1、以及2011年從恩施病圃稻瘟病病樣上分離的lj7-1-2，共5株稻瘟病菌株作為接種菌株。菌株采用高粱粒法-20℃保存，使用前將保存的高粱粒取出至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(pda)平板活化(pda：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水定容至1l)，28℃光照培養(yǎng)5天后取直徑5mm的新鮮菌絲塊轉接至高粱粒培養(yǎng)基中(高粱粒500g加入1.5l蒸餾水，煮至沸騰后濾去液體，將高粱粒撈出裝 入250ml三角瓶，100ml/瓶，濕熱滅菌20分鐘)，10塊/瓶，接菌2天后每天將高粱粒搖散，28℃黑暗培養(yǎng)至菌絲長滿高粱粒。然后將高粱粒攤在無菌紗布上，蓋上無菌的潮濕紗布，在25℃，rh≥95％，12h光照條件下培養(yǎng)4-5天至大量孢子產生，用無菌水(含0.02％吐溫20)洗下孢子，等孢子量混合接種菌株，調整濃度至5×10⁵個/ml。

用混合分生孢子懸浮液噴霧接種cr010007、‘深95b’、谷梅4號及麗江新團黑谷，接種三個重復。接種后罩上透明罩子，28℃黑暗培養(yǎng)24h，然后16h光照培養(yǎng)5天后調查。

調查標準為0級(高抗，hr)：沒有癥狀；1級(抗，r)：很小的褐色病斑；2級(中抗，mr)：直徑約為1mm的褐色病斑；3級(ms，中感)：直接約為2-3mm的帶圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；4級(感，s)：長約1-3cm的橢圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；5級(高感，hs)：長且寬的大橢圓形病斑，病斑融合成片，至葉片枯死。其中0-2級為抗病，3-5級為感病。接種結果見表3和圖4。

表3接種稻瘟菌后的抗性表現(xiàn)

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。